Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.
Слайд бүрт гурван өгүүллийг харуулсан слайдерууд.Слайдуудын дундуур шилжихийн тулд буцах болон дараагийн товчлууруудыг, слайд бүрээр шилжихийн тулд төгсгөлд байрлах слайд хянагчийн товчлууруудыг ашиглана уу.

317 Зэвэрдэггүй ган ороомог хоолой нийлүүлэгчид

Зэвэрдэггүй ган материалын химийн найрлагын хүснэгт

SPACA6 нь эр бэлгийн эсээр илэрхийлэгддэг гадаргуугийн уураг бөгөөд хөхтөн амьтдын бэлгийн нөхөн үржихүйн үед бэлгийн эсийг нэгтгэхэд чухал үүрэгтэй.Энэхүү үндсэн үүргийг үл харгалзан SPACA6-ийн онцлог функцийг сайн ойлгоогүй байна.Бид SPACA6-ийн эсийн гаднах домэйны талст бүтцийг 2.2 Å нарийвчлалтайгаар тодруулж, бараг уян хатан холбогчоор холбогдсон дөрвөн судалтай багц ба Ig-тэй төстэй β-сэндвичүүдээс бүрдсэн хоёр домэйн уураг илрүүлсэн.Энэ бүтэц нь IZUMO1, бэлгийн эсийн нэгдэлтэй холбоотой өөр нэг уурагтай төстэй бөгөөд SPACA6 ба IZUMO1-ийг энд IST супер гэр бүл гэж нэрлэгдэх бордоотой холбоотой уургийн дээд гэр бүлийн үүсгэн байгуулагч гишүүд болгодог.IST супер гэр бүл нь бүтцийн хувьд эрчилсэн дөрвөн мушгиа ба хос дисульфидтэй холбогдсон CXXC хээгээр тодорхойлогддог.Хүний протеомын бүтцэд суурилсан AlphaFold хайлт нь энэ супер гэр бүлийн нэмэлт уургийн гишүүдийг илрүүлсэн;Ялангуяа эдгээр уургийн ихэнх нь бэлгийн эсийг нэгтгэхэд оролцдог.SPACA6 бүтэц ба түүний IST супер гэр бүлийн бусад гишүүдтэй харилцах харилцаа нь хөхтөн амьтдын бэлгийн эсийн нэгдлийн талаарх бидний мэдлэгт байхгүй холбоосыг өгдөг.
Хүний амьдрал бүр хоёр тусдаа гаплоид бэлгийн эсээс эхэлдэг: эцгийн эр бэлгийн эс, эхийн өндөг.Энэхүү эр бэлгийн эс нь эмэгтэй хүний ​​бэлэг эрхтнийг дамжин олон сая эр бэлгийн эсийг дайран өнгөрч, янз бүрийн саад бэрхшээлийг даван туулж1, багтаамжид ордог бөгөөд энэ нь тэдний хөдөлгөөн, гадаргуугийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн үйл явцыг сайжруулдаг2,3,4.Хэдийгээр эр бэлгийн эс болон өндөг бие биенээ олсон ч үйл явц хараахан дуусаагүй байна.Ооцит нь бөөгнөрөл эсүүдийн давхарга ба zona pellucida гэж нэрлэгддэг гликопротеины саадаар хүрээлэгдсэн байдаг бөгөөд сперматозоид түүгээр дамжин өндөг рүү орох ёстой.Spermatozoa нь эдгээр эцсийн саад бэрхшээлийг даван туулахын тулд гадаргуугийн наалдамхай молекулууд болон мембрантай холбоотой болон ялгардаг ферментүүдийн хослолыг ашигладаг5.Эдгээр молекулууд болон ферментүүд нь голчлон дотоод мембран болон акросомын матрицад хадгалагддаг бөгөөд акросомын урвалын үед эр бэлгийн эсийн гадна мембран задрах үед илэрдэг6.Энэхүү эрчимтэй аялалын эцсийн шат нь эр бэлгийн эс-өндөгний нэгдэх үйл явц бөгөөд хоёр эс мембранаа нийлүүлэн нэг диплоид организм болдог7.Хэдийгээр энэ үйл явц нь хүний ​​нөхөн үржихүйн үндэс суурийг тавьсан ч шаардлагатай молекулын харилцан үйлчлэлийг сайн ойлгоогүй байна.
Бэлгийн эсийг бордохоос гадна хоёр липидийн давхар давхаргыг нэгтгэх химийг өргөнөөр судалсан.Ерөнхийдөө мембраны нэгдэл нь уургийн катализаторын бүтцийн өөрчлөлтийг шаарддаг энергийн хувьд тааламжгүй процесс бөгөөд хоёр мембраныг ойртуулж, тэдгээрийн тасралтгүй байдлыг эвдэж, нэгдэл үүсгэдэг8,9.Эдгээр уургийн катализаторыг фузоген гэж нэрлэдэг бөгөөд тоо томшгүй олон хайлуулах системээс олдсон байдаг.Эдгээр нь вирусыг эзэн эсэд нэвтрүүлэхэд шаардлагатай (жишээлбэл, ХДХВ-1-д gp160, коронавирусын өсөлт, томуугийн вирүсийн гемагглютинин)10,11,12 ихэс (синцитин)13,14,15, доод эукариотуудад бэлгийн эс үүсгэгч нэгдэл. HAP2/GCS1 ургамал, протист ба үе хөлт) 16,17,18,19.Хүний бэлгийн эсэд зориулсан фузогенууд хараахан олдоогүй байгаа ч хэд хэдэн уураг нь бэлгийн эсийг хавсаргах, нэгтгэхэд чухал үүрэгтэй болохыг харуулсан.Хулгана болон хүний ​​бэлгийн эсийг нэгтгэхэд шаардлагатай трансмембран уураг болох өндөгний эсээр илэрхийлэгддэг CD9-ийг анх нээсэн 21,22,23.Хэдийгээр түүний нарийн функц тодорхойгүй хэвээр байгаа ч наалдац, өндөгний микровилл дээрх наалдацын голомтуудын бүтэц,/эсвэл өндөгний гадаргуугийн уургийн зөв байрлал нь тодорхойгүй хэвээр байна 24,25,26.Гаметийг нэгтгэхэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг хамгийн ердийн хоёр уураг бол эр бэлгийн эсийн уураг IZUMO127 ба өндөгний эсийн уураг JUNO28 бөгөөд тэдгээрийн харилцан холбоо нь бэлгийн эсийг таних, нэгтгэхээс өмнө наалддаг чухал алхам юм.Эрэгтэй Izumo1 нокаут хулгана, эм Juno нокаут хулганууд нь бүрэн ариутгасан бөгөөд эдгээр загварт эр бэлгийн эс нь перивителлин орон зайд ордог боловч бэлгийн эсүүд хоорондоо нийлдэггүй.Үүний нэгэн адилаар бэлгийн эсийг IZUMO1 эсвэл JUNO27,29 эсрэгбиемүүдээр эмчилсэн үед хүний ​​in vitro бордооны туршилтанд нийлбэр багассан.
Саяхан IZUMO1 ба JUNO20,30,31,32,33,34,35-тай фенотипийн хувьд төстэй эр бэлгийн эсээр илэрхийлэгддэг уургийн бүлэг шинээр нээгдсэн байна.Спермийн акросомын мембрантай холбоотой уураг 6 (SPACA6) нь том хэмжээний хулганы мутагенезийн судалгаагаар бордолтод зайлшгүй шаардлагатай болохыг тогтоосон.Трансгенийг Spaca6 генд оруулах нь хайлах боломжгүй эр бэлгийн эсийг үүсгэдэг боловч эдгээр эр бэлгийн эс нь перивителлин орон зайд нэвчдэг 36 .Хулганад хийсэн дараагийн нокаут судалгаагаар бэлгийн эсийг нэгтгэхэд Spaca6 шаардлагатай болохыг баталжээ 30,32 .SPACA6 нь бараг зөвхөн төмсөгт илэрдэг бөгөөд IZUMO1-тэй төстэй нутагшуулах хэв маягтай, тухайлбал, акросомын урвалын өмнө эр бэлгийн эсийн интима дотор, дараа нь акросомын урвалын дараа экваторын бүс рүү шилждэг 30,32.Spaca6 гомологууд нь янз бүрийн хөхтөн амьтад болон бусад эукариотуудад байдаг 30 бөгөөд хүний ​​бэлгийн эсийн нэгдэлд ач холбогдол нь SPACA6 30-д тэсвэртэй байдгаараа in vitro хүний ​​бордолтыг дарангуйлснаар нотлогдсон.IZUMO1 болон JUNO-аас ялгаатай нь SPACA6-ийн бүтэц, харилцан үйлчлэл, үйл ажиллагааны нарийвчилсан мэдээлэл тодорхойгүй хэвээр байна.
Хүний эр бэлгийн эс болон өндөгний нэгдлийн үндсэн үйл явцыг илүү сайн ойлгохын тулд бид гэр бүл төлөвлөлт, үржил шимийн эмчилгээний ирээдүйн хөгжлийг мэдээлэх боломжийг олгохын тулд SPACA6 бүтэц, биохимийн судалгаа хийсэн.SPACA6-ийн эсийн гаднах домэйны талст бүтэц нь бараг уян хатан бүсүүдээр холбогдсон дөрвөн мушгиа (4HB) ба иммуноглобулинтай төстэй (Ig шиг) домайныг харуулж байна.Өмнөх судалгаануудад таамаглаж байсанчлан, 7,32,37 SPACA6-ийн домайн бүтэц нь хүний ​​IZUMO1-ийн бүтэцтэй төстэй бөгөөд хоёр уураг нь гурвалжин мушгиа гадаргуутай 4HB, хос дисульфидтэй холбогдсон CXXC хээтэй ер бусын хэв маягийг хуваалцдаг.Бид IZUMO1 ба SPACA6 нь бэлгийн эсийн нэгдэлтэй холбоотой илүү том, бүтцийн хувьд хамааралтай уургийн дээд гэр бүлийг тодорхойлохыг санал болгож байна.Супер гэр бүлийн өвөрмөц онцлогуудыг ашиглан бид AlphaFold бүтцийн хүний ​​протеомын талаар нарийвчилсан хайлт хийж, энэ супер гэр бүлийн нэмэлт гишүүд, тэр дундаа бэлгийн эсийн нэгдэл болон/эсвэл бордолттой холбоотой хэд хэдэн гишүүдийг тодруулсан.Одоо бэлгийн эсийг нэгтгэхтэй холбоотой нийтлэг бүтцийн нугалам ба уургийн супер бүлэг байгаа нь харагдаж байна, бидний бүтэц нь хүний ​​бэлгийн эсийн нэгдэх механизмын энэ чухал талыг харуулсан молекулын зураглалыг өгдөг.
SPACA6 нь нэг N-холбогдсон гликан ба зургаан дисульфидын холбоо бүхий нэг дамжлагатай трансмембран уураг юм (Зураг S1a ба S2).Бид Drosophila S2 эсэд хүний ​​SPACA6 (үлдэгдэл 27-246) эсийн гаднах домэйныг илэрхийлж, никельд ойртох чадвар, катион солилцоо, хэмжээ хасах хроматографи ашиглан уураг цэвэршүүлсэн (Зураг S1b).Цэвэршүүлсэн SPACA6 ectodomain нь маш тогтвортой бөгөөд нэгэн төрлийн.Хэмжээ хассан хроматографийг олон өнцөгт гэрлийн сарнилттай (SEC-MALS) хослуулсан шинжилгээгээр тооцоолсон молекул жин нь 26.2 ± 0.5 кДа (Зураг S1c) нэг оргилыг илрүүлсэн.Энэ нь SPACA6 мономер эктодомайн хэмжээтэй тохирч байгаа нь цэвэршүүлэх явцад олигомержилт явагдаагүйг харуулж байна.Үүнээс гадна дугуй дикроизм (CD) спектроскопоор хайлах цэг нь 51.3 ° C (Зураг. S1d, e) холимог α/β бүтцийг илрүүлсэн.CD спектрийн задралын явцад 38.6% α мушгиа, 15.8% β судалтай элементүүд илэрсэн (Зураг S1d).
SPACA6 ectodomain-ийг санамсаргүй матриц үржүүлэх38 ашиглан талсжуулж, 2.2 Å нарийвчлалтай өгөгдлийн багцыг бий болгов (Хүснэгт 1 ба Зураг S3).Бүтэц тодорхойлоход фрагмент дээр суурилсан молекул орлуулалт болон бромидын нөлөөлөл бүхий SAD үе шатлалын өгөгдлийг хослуулан ашиглан (Хүснэгт 1 ба Зураг S4) эцсийн боловсронгуй загвар нь 27-246 үлдэгдэлээс бүрдэнэ.Бүтэцийг тодорхойлох үед туршилтын болон AlphaFold бүтэц байхгүй байсан.SPACA6 ectodomain нь 20 Å × 20 Å × 85 Å хэмжээтэй, долоон мушгиа, есөн β утаснаас бүрдэх ба зургаан дисульфидын холбоогоор тогтворжсон сунасан гуравдагч нугалаатай (Зураг 1a, b).Asn243 хажуугийн гинжин хэлхээний төгсгөлд электроны сул нягтрал нь энэ үлдэгдэл нь N-холбогдсон гликозиляци гэдгийг харуулж байна.Бүтэц нь хоёр домайнаас бүрдэнэ: N-терминал дөрвөн мушгиа багц (4HB) болон тэдгээрийн хооронд завсрын нугасны бүс бүхий C-терминал Ig-тэй төстэй домэйн (Зураг 1c).
a SPACA6 эсийн гаднах домэйны бүтэц.SPACA6-ийн эсийн гаднах домэйны туузан диаграмм, N-ээс C төгсгөл хүртэлх гинжний өнгө нь хар хөхөөс хар улаан хүртэл.Дисульфидын холбоонд оролцдог цистеиныг ягаан өнгөөр ​​тодруулсан.b SPACA6 эсийн гаднах домэйны топологи.Зураг 1а-тай ижил өнгөний схемийг ашиглана.c SPACA6 эсийн гаднах домэйн.4HB, нугас, Ig-тэй төстэй домэйн диаграммууд нь улбар шар, ногоон, цэнхэр өнгөтэй байна.Давхаргууд нь масштабаар зурахгүй.
SPACA6-ийн 4HB домэйнд дөрвөн үндсэн мушгиа (1-4-р мушгиа) багтдаг бөгөөд тэдгээр нь мушгиа хэлбэрийн мушгиа хэлбэртэй (Зураг 2а), эсрэг болон зэрэгцээ харилцан үйлчлэлийн хооронд ээлжлэн байрладаг (Зураг 2б).Жижиг нэмэлт нэг эргэлттэй мушгиа (1′) багцад перпендикуляр байрлуулж, 1 ба 2 мушгиа бүхий гурвалжин үүсгэдэг. Энэ гурвалжин нь 3 ба 4-р мушгиатай харьцангуй нягт савлагааны мушгиа-эрчилсэн савлагаанд бага зэрэг гажсан байна. Зураг 2a).
4HB N-терминал зурвас диаграм.b Дөрвөн мушгиа бүхий багцын дээд харагдах байдал, мушгиа бүрийг N төгсгөлд хар хөх, C төгсгөлд хар улаан өнгөөр ​​тодруулсан.c Үлдэгдэл бүрийг нэг үсэгтэй амин хүчлийн кодоор тэмдэглэсэн тойрог хэлбэрээр харуулсан 4HB-ийн дээрээс доошоо спираль дугуйны диаграмм;Дугуйны дээд талд байгаа дөрвөн амин хүчлийг л дугаарласан.Туйл бус үлдэгдэл шар өнгөтэй, туйлын цэнэггүй үлдэгдэл ногоон өнгөтэй, эерэг цэнэгтэй үлдэгдэл цэнхэр өнгөтэй, сөрөг цэнэгтэй үлдэгдэл улаан өнгөтэй байна.d 4HB домэйны гурвалжин нүүрүүд, 4HBs улбар шар, нугас нь ногоон өнгөтэй.Хоёр оруулга нь саваа хэлбэртэй дисульфидын холбоог харуулж байна.
4HB нь гол төлөв алифатик болон үнэрт үлдэгдэлээс бүрдэх дотоод гидрофобик цөмд төвлөрдөг (Зураг 2c).Цөм нь Cys41 ба Cys55-ын хоорондох дисульфидын холбоог агуулдаг бөгөөд 1 ба 2-р мушгиауудыг дээд өргөгдсөн гурвалжинд холбодог (Зураг 2d).Helix 1′ дахь CXXC хээ болон нугасны бүс дэх β-үсний хавчаарын үзүүрээс олдсон өөр CXXC хээний хооронд хоёр нэмэлт дисульфидын холбоо үүссэн (Зураг 2d).Үл мэдэгдэх функцтэй консерватив аргинины үлдэгдэл (Arg37) нь 1′, 1, 2-р мушгиауудаас үүссэн хөндий гурвалжин дотор байрладаг. Алифатик нүүрстөрөгчийн атомууд Cβ, Cγ, Cδ Arg37 нь гидрофобик цөмтэй харилцан үйлчилж, түүний гуанидины бүлгүүд мөчлөгөөр хөдөлдөг. Thr32 нуруу ба хажуугийн гинж хоорондын харилцан үйлчлэлээр 1′ ба 1 мушгиа хооронд (Зураг S5a,b).Tyr34 нь хөндий рүү сунаж, Arg37 нь уусгагчтай харилцан үйлчлэх боломжтой хоёр жижиг хөндий үлдээдэг.
Ig төст β-сэндвич домайнууд нь гидрофоб цөмөөр харилцан үйлчлэлцдэг хоёр ба түүнээс дээш олон судалтай амфипатик β-хуудасны нийтлэг шинж чанарыг хуваалцдаг уургийн том супер гэр бүл юм. ба хоёр давхаргаас бүрдэнэ (Зураг S6a).1-р хуудас нь дөрвөн судалтай (D, F, H, I утаснууд) β хуудас бөгөөд F, H, I утаснууд нь эсрэг параллель зохицуулалт үүсгэдэг ба I ба D хэлхээ нь зэрэгцээ харилцан үйлчлэлд ордог.Хүснэгт 2 нь жижиг эсрэг параллель давхар судалтай бета хуудас (E ба G хэлхээ).E гинжин хэлхээний С төгсгөл ба H гинжин хэлхээний төв (Cys170-Cys226) хооронд дисульфидын дотоод холбоо ажиглагдсан (Зураг S6b).Энэхүү дисульфидын холбоо нь иммуноглобулины β-сэндвич домайн дахь дисульфидын бондтой төстэй юм40,41.
Дөрвөн судалтай β хуудас нь бүхэл бүтэн уртын дагуу эргэлдэж, хэлбэр, цахилгаан статикаар ялгаатай тэгш бус ирмэгийг үүсгэдэг.Нимгэн ирмэг нь SPACA6-д үлдсэн тэгш бус, электростатик ялгаатай гадаргуутай харьцуулахад ялгарах хавтгай гидрофобик орчны гадаргуу юм (Зураг S6b,c).Ил задгай нурууны карбонил/амин бүлгүүд ба туйлын хажуугийн гинжин хэлхээ нь гидрофобик гадаргууг хүрээлдэг (Зураг S6c).Илүү өргөн зах нь гидрофобик голын N-терминал хэсгийг хааж, F гинжин хэлхээний голын нээлттэй туйлтай бүлэгтэй гурван устөрөгчийн холбоо үүсгэдэг таглаатай мушгиа сегментээр бүрхэгдсэн байдаг (Зураг S6d).Энэ ирмэгийн C төгсгөлийн хэсэг нь хэсэгчлэн ил гарсан гидрофобик цөмтэй том халаас үүсгэдэг.Халаас нь гурван багц давхар аргинин үлдэгдэл (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ба Arg212-Arg214) ба төвийн гистидин (His220) зэргээс шалтгаалан эерэг цэнэгүүдээр хүрээлэгдсэн байдаг (Зураг S6e).
Нугасны бүс нь нэг эсрэг параллель гурван судалтай β-давхарга (A, B, C утаснууд), жижиг 310 мушгиа, хэд хэдэн урт санамсаргүй мушгиа сегментээс бүрдэх мушгиа болон Ig-тэй төстэй домэйны хоорондох богино сегмент юм.(Зураг S7).Нугасны бүс дэх ковалент ба электростатик контактуудын сүлжээ нь 4HB ба Ig-тэй төстэй домайн хоорондын чиг баримжааг тогтворжуулж байгаа бололтой.Сүлжээг гурван хэсэгт хувааж болно.Эхний хэсэгт нугас дахь β-үсний хавчаар ба 4HB-ийн 1′ мушгиа хоёрын хооронд хос дисульфидын холбоо үүсгэдэг CXXC-ийн хоёр хээ (27CXXC30 ба 139CXXC142) багтсан болно.Хоёрдахь хэсэг нь Ig-тэй төстэй домэйн ба нугасны хоорондох электростатик харилцан үйлчлэлийг агуулдаг.Нугас дахь Glu132 нь Ig-тэй төстэй домайн дахь Arg233, нугас дахь Arg135-тай давсны гүүр үүсгэдэг.Гурав дахь хэсэг нь Ig-тэй төстэй домэйн ба нугасны бүс хоорондын ковалент холбоог агуулдаг.Хоёр дисульфидын холбоо (Cys124-Cys147 ба Cys128-Cys153) нь нугасны гогцоог Gln131 болон нурууны функциональ бүлгийн хоорондох электростатик харилцан үйлчлэлээр тогтворжсон холбогчтой холбож, анхны Ig-тэй төстэй домайн руу нэвтрэх боломжийг олгодог.гинж.
SPACA6 ectodomain-ийн бүтэц, 4HB болон Ig-тэй төстэй домайнуудын бие даасан бүтцийг уургийн мэдээллийн сангаас бүтцийн хувьд ижил төстэй бичлэгүүдийг хайхад ашигласан 42 .Бид Dali Z-ийн өндөр оноотой, жижиг стандарт хазайлттай, LALI-ийн том оноотой (сүүлийнх нь бүтцийн хувьд ижил төстэй үлдэгдлийн тоо) таарч байгааг тодорхойлсон.Эктодомайн бүрэн хайлтын эхний 10 хандалт (Хүснэгт S1) нь зөвшөөрөгдөхүйц Z оноотой >842 байсан бол зөвхөн 4HB эсвэл Ig-тэй төстэй домайныг хайхад эдгээр цохилтын ихэнх нь зөвхөн β-сэндвичтэй таарч байгааг харуулсан.олон уурагт агуулагддаг хаа сайгүй атираа.Дали дахь гурван хайлт бүгд зөвхөн нэг үр дүнг олсон: IZUMO1.
SPACA6 болон IZUMO1 нь бүтцийн хувьд ижил төстэй байдаг7,32,37 гэж эртнээс санал болгосоор ирсэн.Хэдийгээр эдгээр хоёр бэлгийн эсийн нэгдэлтэй холбоотой уургийн эктодомайнууд нь зөвхөн 21% дарааллын онцлогтой байдаг (Зураг S8a) SPACA6 дахь хадгалагдсан дисульфидын бондын загвар, урьдчилан таамагласан C-терминал Ig-тэй төстэй домэйн зэрэг цогц нотлох баримтууд нь бэлгийн эсийг бий болгох эрт оролдлого хийх боломжийг олгосон. IZUMO1-ийг загвар болгон ашигласан A болон SPACA6 хулганы ижил төстэй загвар37.Манай бүтэц эдгээр таамаглалыг баталж, ижил төстэй байдлын жинхэнэ түвшинг харуулж байна.Үнэн хэрэгтээ SPACA6 ба IZUMO137,43,44 бүтэц нь нугасны бүсээр холбогдсон ижил төстэй 4HB ба Ig-тэй төстэй β-сэндвич домайнуудтай ижил хоёр домэйн архитектурыг (Зураг. S8b) хуваалцдаг (Зураг. S8c).
IZUMO1 ба SPACA6 4HB нь ердийн спираль багцуудаас нийтлэг ялгаатай байдаг.Ердийн 4HBs нь эндосомын нэгдэл 45,46-д оролцдог SNARE уургийн цогцолборуудаас олддог шиг төв тэнхлэгийн эргэн тойронд тогтмол муруйлтыг хадгалдаг жигд зайтай мушгиа хэлбэртэй байдаг 47. Үүний эсрэгээр IZUMO1 ба SPACA6 хоёулангийнх нь мушгиа домэйнууд гажсан ба хувьсах муруйлттай, жигд бус савлагаа (Зураг S8d).1′, 1, 2 мушгианаас үүссэн гурвалжингаас үүссэн мушгиа нь IZUMO1 болон SPACA6-д хадгалагдаж, 1′ мушгиа дээрх ижил CXXC хээгээр тогтворжсон.Гэсэн хэдий ч SPACA6-д олдсон нэмэлт дисульфидын холбоо (Дээрх 1 ба 2-р мушгиа холбогч Cys41 ба Cys55) нь гурвалжны орой дээр илүү хурц үзүүрийг үүсгэж, SPACA6-г IZUMO1-ээс илүү мушгирсан, илүү тод хөндий гурвалжинтай болгодог.Нэмж дурдахад IZUMO1-д SPACA6 дахь энэ хөндийн төвд ажиглагдсан Arg37 байхгүй.Үүний эсрэгээр, IZUMO1 нь алифатик болон үнэрт үлдэгдэл агуулсан илүү ердийн гидрофобик цөмтэй байдаг.
IZUMO1 нь хоёр ба таван судалтай β хуудас43-аас бүрдэх Ig-тэй төстэй домайнтай.IZUMO1 дахь нэмэлт утас нь SPACA6 дахь ороомгийг орлуулж, F хэлхээтэй харилцан үйлчилж, судал дахь үндсэн устөрөгчийн холбоог хязгаарладаг.Харьцуулах сонирхолтой цэг бол хоёр уургийн Ig-тэй төстэй домайнуудын гадаргуугийн цэнэгийн тооцоолол юм.IZUMO1 гадаргуу нь SPACA6 гадаргуугаас илүү сөрөг цэнэгтэй байдаг.Нэмэлт цэнэг нь эр бэлгийн эсийн мембран руу чиглэсэн С төгсгөлийн ойролцоо байрладаг.SPACA6-д ижил бүсүүд илүү төвийг сахисан эсвэл эерэг цэнэгтэй байсан (Зураг S8e).Жишээлбэл, SPACA6 дахь гидрофобик гадаргуу (нимгэн ирмэгүүд) болон эерэг цэнэгтэй нүхнүүд (илүү өргөн ирмэгүүд) IZUMO1-д сөрөг цэнэгтэй байдаг.
IZUMO1 болон SPACA6 хоорондын хамаарал болон хоёрдогч бүтцийн элементүүд сайн хадгалагдан үлдсэн боловч Ig төст домэйнуудын бүтцийн уялдаа холбоо нь хоёр домэйн нь бие биенээсээ ерөнхий чиг баримжаагаараа ялгаатай болохыг харуулсан (Зураг S9).IZUMO1-ийн спираль багц нь β-сэндвичийг тойрон муруйсан бөгөөд төв тэнхлэгээс 50°-ын зайд өмнө нь дүрсэлсэн "бумеранг" хэлбэрийг бий болгодог.Үүний эсрэгээр, SPACA6 дахь мушгиа туяа нь эсрэг чиглэлд 10 ° орчим хазайсан байв.Эдгээр чиглэлийн ялгаа нь нугасны бүсийн ялгаатай байдлаас үүдэлтэй байх магадлалтай.Анхан шатны дарааллын түвшинд IZUMO1 ба SPACA6 нь цистеин, глицин, аспартик хүчлийн үлдэгдэл зэргийг эс тооцвол нугасны дарааллын ижил төстэй байдлыг хуваалцдаг.Үүний үр дүнд устөрөгчийн холбоо, цахилгаан статик сүлжээ нь огт өөр юм.β хуудасны хоёрдогч бүтцийн элементүүдийг IZUMO1 ба SPACA6 хуваалцдаг боловч IZUMO1 дахь гинж нь илүү урт бөгөөд 310 мушгиа (helix 5) нь SPACA6-д өвөрмөц байдаг.Эдгээр ялгаа нь ижил төстэй хоёр уургийн хувьд өөр өөр чиглэлийг бий болгодог.
Бидний Дали серверийн хайлтаар SPACA6 ба IZUMO1 нь уургийн мэдээллийн санд хадгалагдаж буй туршилтаар тодорхойлогдсон цорын ганц хоёр бүтэц бөгөөд 4HB нугалаатай болохыг олж мэдсэн (Хүснэгт S1).Саяхан DeepMind (Alphabet/Google) анхдагч дарааллаас уургийн 3D бүтцийг нарийн таамаглах боломжтой мэдрэлийн сүлжээнд суурилсан AlphaFold системийг бүтээжээ48.Биднийг SPACA6 бүтцийг шийдсэний дараахан AlphaFold мэдээллийн сан гарч, хүний ​​протеомын бүх уургийн 98.5%-ийг хамарсан бүтцийн урьдчилан таамаглах загваруудыг гаргаж өгсөн48,49.Бидний шийдэгдсэн SPACA6 бүтцийг хайлтын загвар болгон ашиглан хүний ​​AlphaFold протеом дахь загварт бүтцийн ижил төстэй хайлт хийснээр SPACA6 болон IZUMO1-тэй бүтцийн хувьд ижил төстэй байж болох нэр дэвшигчдийг тодорхойлсон.AlphaFold-ийн SPACA6-г (Зураг. S10a) урьдчилан таамаглах гайхалтай нарийвчлалыг харгалзан үзвэл, ялангуяа 1.1 Å rms эктодомэйныг бидний шийдсэн бүтэцтэй (Зураг. S10b) харьцуулбал бид тодорхойлсон SPACA6 тохирол үнэн зөв байх магадлалтай гэдэгт итгэлтэй байж болно.
Өмнө нь PSI-BLAST нь IZUMO2, IZUMO3, IZUMO450 гэсэн гурван эр бэлгийн эстэй холбоотой IZUMO1 кластерийг хайж байсан.АльфаФолд эдгээр IZUMO гэр бүлийн уургууд нь IZUMO1 (Зураг 3a ба S11)-тэй ижил дисульфидын бондын загвараар 4HB домэйнд нугалж, Ig-тэй төстэй домэйн байхгүй гэж таамаглаж байна.IZUMO2 ба IZUMO3 нь IZUMO1-тэй төстэй нэг талт мембран уураг гэж таамаглаж байгаа бол IZUMO4 нь ялгардаг бололтой.Гаметийн нэгдэл дэх IZUMO 2, 3, 4 уургийн үүрэг тодорхойлогдоогүй байна.IZUMO3 нь эр бэлгийн эсийг хөгжүүлэх явцад акросомын биогенезид чухал үүрэг гүйцэтгэдэг51 бөгөөд IZUMO уураг нь цогцолбор үүсгэдэг50.Хөхтөн амьтад, хэвлээр явагчид, хоёр нутагтан амьтдын IZUMO уургийн хадгалалт нь тэдний боломжит функц нь DCST1/2, SOF1, FIMP зэрэг бэлгийн эсийн нэгдэлтэй холбоотой бусад уургуудтай нийцэж байгааг харуулж байна.
Улбар шар, ногоон, цэнхэр өнгөөр ​​тус тус тодруулсан 4HB, нугас, Ig-тэй төстэй домэйн бүхий IST супер гэр бүлийн домайн архитектурын диаграмм.IZUMO4 нь хар өнгөтэй харагддаг өвөрмөц C терминалын бүстэй.Батлагдсан болон таамагласан дисульфидын холбоог хатуу ба тасархай шугамаар тус тус үзүүлэв.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1Zoldha (TMEMAl89p), DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) нь А самбарын өнгөний мужид харагдана. Дисульфидын холбоог ягаан өнгөөр ​​үзүүлэв.TMEM95, IZUMO2 ба IZUMO3 трансмембран спиральуудыг харуулаагүй болно.
IZUMO уургаас ялгаатай нь бусад SPACA уургууд (жишээлбэл, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, SPACA9) нь SPACA6-аас бүтцийн хувьд ялгаатай гэж үздэг (Зураг S12).Зөвхөн SPACA9 нь 4HB-тэй боловч энэ нь SPACA6-тай ижил параллель-эсрэг параллель чиг баримжаа эсвэл дисульфидын холбоо байх ёсгүй.Зөвхөн SPACA1 нь ижил төстэй Ig-тэй төстэй домэйнтэй.AlphaFold нь SPACA3, SPACA4, SPACA5 нь SPACA6-аас тэс өөр бүтэцтэй гэж таамаглаж байна.Сонирхолтой нь SPACA4 нь бордолтод чухал үүрэг гүйцэтгэдэг боловч SPACA6-аас илүүтэйгээр эр бэлгийн эс болон өндөгний бүсийн pellucida хоорондын харилцан үйлчлэлийг хөнгөвчилдөг52.
Бидний AlphaFold хайлт нь IZUMO1 болон SPACA6 4HB, TMEM95-д тохирох өөр хувилбарыг оллоо.TMEM95 нь эр бэлгийн эсийн өвөрмөц трансмембран уураг бөгөөд 32,33-ыг арилгахад эр хулганыг үргүй болгодог.TMEM95-ийн дутагдалтай эр бэлгийн эс нь хэвийн морфологи, хөдөлгөөнтэй, бүсэлхийд нэвтэрч, өндөгний мембрантай холбогдох чадвартай боловч өндөгний мембрантай нэгдэж чадахгүй байв.Өмнөх судалгаагаар TMEM95 нь IZUMO133-тай бүтцийн хувьд ижил төстэй байдгийг харуулсан.Үнэн хэрэгтээ AlphaFold загвар нь TMEM95 нь IZUMO1 ба SPACA6-тай ижил хос CXXC хээтэй, SPACA6-д олдсон 1 ба 2-р мушгиа хоорондын дисульфидын нэмэлт холболттой 4HB гэдгийг баталсан (Зураг 3a ба S11).Хэдийгээр TMEM95 нь Ig-тэй төстэй домэйнгүй боловч SPACA6 болон IZUMO1 нугасны бүсүүдтэй төстэй дисульфидын бондын загвар бүхий бүстэй байдаг (Зураг 3b).Энэхүү гар бичмэлийг нийтлэх үед хэвлэлийн өмнөх сервер нь TMEM95-ийн бүтцийг мэдээлсэн нь AlphaFold53 үр дүнг баталгаажуулсан.TMEM95 нь SPACA6 болон IZUMO1-тэй маш төстэй бөгөөд хоёр нутагтан амьтдад хувьслын хувьд аль хэдийн хадгалагдсан байдаг (Зураг 4 ба S13).
PSI-BLAST хайлт нь NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, SOF1 мэдээллийн санг ашиглан эдгээр дарааллын амьдралын мод дахь байрлалыг тодорхойлсон.Салбар цэгүүдийн хоорондох зайг масштабаар харуулахгүй.
SPACA6 ба IZUMO1-ийн бүтцийн ерөнхий ижил төстэй байдал нь тэдгээр нь TMEM95 ба IZUMO 2, 3, 4 уураг агуулсан хадгалагдсан бүтцийн супер гэр бүлийн үндэслэгч гишүүд болохыг харуулж байна.мэдэгдэж байгаа гишүүд: IZUMO1, SPACA6 болон TMEM95.Цөөн тооны гишүүд Ig-тэй төстэй домайныг эзэмшдэг тул IST супер гэр бүлийн онцлог нь 4HB домэйн бөгөөд эдгээр бүх уургуудад нийтлэг байдаг өвөрмөц онцлогтой: 1) Зэрэгцээ/зэрэгцээ ээлжлэн ээлжлэн байрлуулсан ороомогтой 4HB (Зураг 1) 5a), 2) багц нь багц доторх хоёр мушгиа, гурав дахь босоо мушгиа (Зураг. Түлхүүр хэсэг (Зураг 5в)) гурвалжин хэлбэртэй нүүртэй. Тиоредоксинтэй төстэй уургуудаас олддог CXXC мотив нь үйл ажиллагаагаа явуулдаг. исэлдэлтийн мэдрэгчээр 54,55,56 , харин IST гэр бүлийн гишүүдийн мотив нь бэлгийн эсийн нэгдэл дэх ERp57 зэрэг уургийн дисульфид изомеразатай холбоотой байж болно.Үүрэг холбоотой 57,58.
IST супер гэр бүлийн гишүүд нь 4HB домэйны гурван онцлог шинжээр тодорхойлогддог: параллель ба эсрэг чиглэлийн хооронд ээлжлэн оршдог дөрвөн мушгиа, гурвалжин хэлбэртэй мушгиа багц нүүр, жижиг молекулуудын хооронд үүссэн ca CXXC давхар мотив.) N төгсгөлийн мушгиа (улбар шар) ба нугасны бүс β-үсний хавчаар (ногоон).
SPACA6 ба IZUMO1-ийн ижил төстэй байдлыг харгалзан эхнийх нь IZUMO1 эсвэл JUNO-тай холбогдох чадварыг шалгасан.Био давхаргын интерферометр (BLI) нь IZUMO1 ба JUNO хоорондын харилцан үйлчлэлийн хэмжээг тодорхойлоход өмнө нь ашиглаж байсан кинетикт суурилсан холбох арга юм.Биотин шошготой мэдрэгчийг JUNO аналитын өндөр агууламжтай өгөөш болгон IZUMO1-ээр инкубацласны дараа хүчтэй дохио илэрсэн (Зураг. S14a) нь мэдрэгчийн үзүүрт наасан биоматериалын зузааныг холбохоос үүдэлтэй өөрчлөлтийг харуулж байна.Ижил төстэй дохио (өөрөөр хэлбэл, JUNO мэдрэгчтэй IZUMO1 аналитын эсрэг өгөөш болгон холбосон) (Зураг. S14b).SPACA6-г мэдрэгчтэй холбогдсон IZUMO1 эсвэл мэдрэгчтэй холбогдсон JUNO-ийн эсрэг аналитик болгон ашиглахад ямар ч дохио илрээгүй (Зураг S14a,b).Энэ дохио байхгүй байгаа нь SPACA6-ийн эсийн гаднах домэйн нь IZUMO1 эсвэл JUNO-ийн эсийн гаднах домэйнтэй харьцдаггүйг харуулж байна.
BLI-ийн шинжилгээ нь өгөөшний уураг дээрх чөлөөт лизин үлдэгдлийг биотинилжүүлэхэд суурилдаг тул энэхүү өөрчлөлт нь лизин үлдэгдэл харилцан үйлчлэлд оролцсон тохиолдолд холбогдохоос сэргийлж чадна.Нэмж дурдахад мэдрэгчтэй холбоотой холболтын чиг баримжаа нь стерик саадыг үүсгэж болзошгүй тул ердийн сугалах шинжилгээг рекомбинант SPACA6, IZUMO1 болон JUNO эктодомууд дээр хийсэн.Гэсэн хэдий ч SPACA6 нь His-tagged IZUMO1 эсвэл His-tagged JUNO (Зураг. S14c,d)-тай тунадас үүсээгүй нь BLI туршилтанд ажиглагдсантай нийцэхгүй байгааг харуулж байна.Эерэг хяналтын хувьд бид JUNO-ийн Түүний IZUMO1 шошготой (Зураг S14e ба S15) харилцан үйлчлэлийг баталгаажуулсан.
SPACA6 ба IZUMO1-ийн бүтцийн ижил төстэй байдлыг үл харгалзан SPACA6 нь JUNO-г холбох боломжгүй байгаа нь гайхмаар зүйл биш юм.Хүний IZUMO1-ийн гадаргуу нь JUNO-тай харилцан үйлчилдэг 20 гаруй үлдэгдэлтэй, үүнд гурван бүс тус бүрийн үлдэгдэл байдаг (хэдийгээр тэдгээрийн ихэнх нь нугасны бүсэд байрладаг) (Зураг S14f).Эдгээр үлдэгдэлээс зөвхөн нэг нь SPACA6 (Glu70)-д хадгалагддаг.Олон тооны үлдэгдэл орлуулалт нь анхны биохимийн шинж чанараа хадгалж үлдсэн боловч IZUMO1 дахь чухал Arg160 үлдэгдэл нь SPACA6 дахь сөрөг цэнэгтэй Asp148-аар солигдсон;Өмнөх судалгаагаар IZUMO1-ийн Arg160Glu мутаци нь JUNO43-тай холбогдохыг бараг бүрэн устгадаг болохыг харуулсан.Нэмж дурдахад, IZUMO1 ба SPACA6-ийн хоорондох домэйн чиглэлийн ялгаа нь SPACA6 дээрх эквивалент бүсийн JUNO-тай холбогдох талбайн гадаргуугийн талбайг ихээхэн нэмэгдүүлсэн (Зураг S14g).
Хэдийгээр бэлгийн эсийг нэгтгэх SPACA6 хэрэгцээ, IZUMO1-тэй ижил төстэй байгаа хэдий ч SPACA6 нь JUNO-тай тэнцэх үүрэг гүйцэтгэдэггүй бололтой.Тиймээс бид бүтцийн өгөгдлөө хувьслын биологийн ач холбогдлын нотолгоотой нэгтгэхийг хичээсэн.SPACA6 гомологуудын дарааллын дагуулал нь хөхтөн амьтдаас гадна нийтлэг бүтэц хадгалагдаж байгааг харуулж байна.Жишээлбэл, цистеины үлдэгдэл нь хол ойрын хоёр нутагтан амьтдад ч байдаг (Зураг 6a).ConSurf серверийг ашиглан 66 дарааллын олон дарааллын тохируулгын хадгалалтын өгөгдлийг SPACA6 гадаргуу дээр буулгасан.Энэ төрлийн шинжилгээ нь уургийн хувьслын явцад ямар үлдэгдэл хадгалагдаж байсныг харуулж, гадаргуугийн аль бүсүүд үйл ажиллагаанд үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж чадна.
a CLUSTAL OMEGA ашиглан бэлтгэсэн 12 өөр зүйлийн SPACA6 ectodomains-ийн дарааллаар.ConSurf шинжилгээний дагуу хамгийн консерватив байрлалыг цэнхэр өнгөөр ​​тэмдэглэсэн байна.Цистеины үлдэгдлийг улаанаар тодруулсан.Домэйн хил ба хоёрдогч бүтцийн элементүүдийг эгнээний дээд хэсэгт харуулсан ба сумнууд нь β-судаануудыг, долгион нь мушгиауудыг заадаг.Дарааллыг агуулсан NCBI хандалтын танигч нь: хүн (Homo sapiens, NP_001303901), мандрилл (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), капучин сармагчин (Cebus mimic, XP_017359366), морь (Equcin3, killeball, XP_0172), us orca3_23 XP_032_034) .), хонь (Ovis aries, XP_014955560), заан (Loxodonta africana, XP_010585293), нохой (Canis lupus familyis, XP_025277208), хулгана (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanianilu de XP_01, XP16 318), Платипус, 8) , 61_89 болон Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Дугаарлалт нь хүний ​​дарааллаар хийгддэг.b Дээд талд нь 4HB, доод талд нь Ig-тэй төстэй домайн бүхий SPACA6 бүтцийн гадаргуугийн дүрслэл, ConSurf серверийн хамгааллын тооцоонд үндэслэсэн өнгө.Хамгийн сайн хадгалагдсан хэсэг нь цэнхэр, дунд зэргийн хадгалагдсан хэсэг нь цагаан, хамгийн бага хадгалагдсан хэсэг нь шар өнгөтэй байна.ягаан цистеин.Өндөр түвшний хамгаалалтыг харуулсан гурван гадаргуугийн нөхөөсийг 1, 2, 3-р шошготой засварууд дээр харуулав. Баруун дээд хэсэгт 4HB хүүхэлдэйн киног харуулсан байна (ижил өнгөт схем).
SPACA6 бүтэц нь гадаргуугийн өндөр хамгаалагдсан гурван бүстэй (Зураг 6б).1-р нөхөөс нь 4HB болон нугасны бүсийг хамардаг бөгөөд хадгалагдсан хоёр CXXC дисульфидын гүүр, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 нугасны сүлжээ (Зураг S7) болон гурван хадгалагдсан гадаад үнэрт үлдэгдэл (Phe31, Tyr73, Phe137) агуулдаг.эр бэлгийн эсийн гадаргуу дээрх хэд хэдэн эерэг цэнэгтэй үлдэгдлийг илэрхийлдэг Ig төст домэйны өргөн хүрээ (Зураг. S6e).Сонирхолтой нь, энэ нөхөөс нь өмнө нь SPACA6 30 үйл ажиллагаанд саад учруулж байсан эсрэгбиеийн эпитоп агуулсан байдаг.3-р бүс нь Ig-тэй төстэй домэйны нугас ба нэг талыг хамардаг;Энэ бүс нутагт хадгалагдсан пролин (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) болон гадагш чиглэсэн туйлтай/цэнэглэгдсэн үлдэгдэл агуулагддаг.Гайхалтай нь, 4HB-ийн гадаргуу дээрх ихэнх үлдэгдэл нь маш их хувьсах чадвартай байдаг (Зураг 6b), хэдийгээр нугалаа нь SPACA6 гомологийн туршид (гидрофобик багцын голын консерватизмаар тодорхойлогддог) болон IST superfamily-ээс гадуур хадгалагддаг.
Хэдийгээр энэ нь SPACA6 дахь хамгийн бага хоёрдогч бүтцийн элементтэй хамгийн жижиг бүс боловч нугасны бүсийн олон үлдэгдэл (3-р бүсийг оруулаад) SPACA6 гомологуудын дунд маш их хадгалагдсан байдаг нь мушгиа болон β-сэндвичийн чиглэл чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.консерватив хүний ​​хувьд.Гэсэн хэдий ч, SPACA6 ба IZUMO1-ийн нугасны бүсэд устөрөгчийн холболт болон цахилгаан статик сүлжээг үл харгалзан, IZUMO137,43,44-ийн зөвшөөрөгдсөн олон бүтцийг тэгшлэх нь дотоод уян хатан байдлын нотолгоог харж болно.Бие даасан домэйнуудын уялдаа холбоо сайн давхцаж байсан боловч бие биентэйгээ харьцуулахад домэйнуудын чиглэл нь төв тэнхлэгээс 50 ° -аас 70 ° хооронд хэлбэлзэж байв (Зураг S16).Уусмал дахь SPACA6-ийн конформацийн динамикийг ойлгохын тулд SAXS туршилтыг хийсэн (Зураг S17a,b).SPACA6 ectodomain-ийн Ab initio сэргээн босголт нь саваа болор бүтэцтэй нийцсэн (Зураг. S18) хэдий ч Краткигийн график нь тодорхой хэмжээний уян хатан чанарыг харуулсан (Зураг. S17b).Энэхүү конформаци нь IZUMO1-ээс ялгаатай бөгөөд үүнд холбогдоогүй уураг нь торонд болон уусмалд бумеранг хэлбэртэй байдаг43.
Уян хатан бүсийг тусгайлан тодорхойлохын тулд SPACA6 дээр устөрөгч-дейтерийн солилцооны массын спектроскопи (H-DXMS) хийж, өмнө нь IZUMO143 дээр олж авсан өгөгдөлтэй харьцуулсан (Зураг 7a,b).SPACA6 нь IZUMO1-ээс илүү уян хатан байдаг нь 100,000 секундын турш солилцооны дараа бүтцэд их хэмжээний дейтерийн солилцоо байгааг харуулж байна.Хоёр бүтцэд нугасны бүсийн C-терминал хэсэг нь солилцооны өндөр түвшинг харуулдаг бөгөөд энэ нь 4HB болон Ig-тэй төстэй домэйнуудын бие биентэйгээ харьцуулахад хязгаарлагдмал эргэлтийг зөвшөөрдөг.Сонирхолтой нь, 147CDLPLDCP154 үлдэгдэлээс бүрдэх SPACA6 нугасны C-терминал хэсэг нь маш их хамгаалагдсан бүс 3 (Зураг 6б) бөгөөд домэйн хоорондын уян хатан байдал нь SPACA6-ийн хувьслын хувьд хадгалагдсан шинж чанар гэдгийг харуулж магадгүй юм.Уян хатан байдлын шинжилгээний дагуу CD-ийн дулааны хайлмал өгөгдөл нь SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) нь IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) -аас бага тогтвортой байгааг харуулсан (Зураг S1e ба S19).
a SPACA6 болон b IZUMO1-ийн H-DXMS зураг.Заасан цаг хугацааны цэгүүдэд дейтерийн солилцооны хувь хэмжээг тодорхойлсон.Устөрөгч-дейтерийн солилцооны түвшинг цэнхэр (10%)-аас улаан (90%) хүртэлх градиент масштабаар өнгөөр ​​тэмдэглэнэ.Хар хайрцаг нь өндөр солилцооны бүс нутгийг илэрхийлдэг.Кристал бүтцэд ажиглагдсан 4HB, нугас, Ig-тэй төстэй домэйны хил хязгаарыг анхдагч дарааллын дээр харуулав.10, 1000, 100,000 секундэд дейтерийн солилцооны түвшинг SPACA6 ба IZUMO1-ийн тунгалаг молекулын гадаргуу дээр байрлуулсан туузан график дээр зурсан.Дейтерийн солилцооны түвшин 50% -иас бага байгаа бүтцийн хэсгүүд нь цагаан өнгөтэй байна.H-DXMS солилцооны 50% -иас дээш талбайг градиент масштабаар будна.
CRISPR/Cas9 болон хулганы генийг устгах генийн стратегийг ашигласнаар эр бэлгийн эс, өндөгний нэгдэл, нэгдэлд чухал ач холбогдолтой хэд хэдэн хүчин зүйлийг тодорхойлоход хүргэсэн.IZUMO1-JUNO болон CD9 бүтцийн сайн харилцан үйлчлэлээс гадна бэлгийн эсийн нэгдэлтэй холбоотой ихэнх уургууд нь бүтэц, үйл ажиллагааны хувьд нууцлаг хэвээр байна.SPACA6-ийн биофизикийн болон бүтцийн шинж чанар нь бордооны үед наалддаг молекулын тааврын өөр нэг хэсэг юм.
SPACA6 болон IST супер овгийн бусад гишүүд хөхтөн амьтад, түүнчлэн бие даасан шувууд, хэвлээр явагчид, хоёр нутагтан амьтдад маш их хадгалагдсан байдаг;Үнэндээ SPACA6 нь тахө 59-ийн бордолтод шаардлагатай гэж үздэг. Энэ тархалт нь DCST134, DCST234, FIMP31, SOF132 зэрэг бэлгийн эсийн нэгдэлтэй холбоотой бусад уурагтай төстэй бөгөөд эдгээр хүчин зүйлүүд нь HAP2-ийн дутагдалтай байгааг харуулж байна. GCS1 гэгддэг) уургууд нь олон протистуудын катализаторын үйл ажиллагааг хариуцдаг., ургамал, үе хөлт.Бордсон хайлуулсан уургууд 60, 61. SPACA6 ба IZUMO1 хоёрын хооронд бүтцийн хувьд ижил төстэй байгаа хэдий ч эдгээр уургийн аль нэгийг кодлодог генүүд тасарсан нь эр хулгана үргүйдэлд хүргэсэн нь бэлгийн эсийн нэгдэл дэх үүрэг нь давхарддаггүйг харуулж байна..Илүү өргөнөөр хэлбэл, нэгдэх наалдацын үе шатанд шаардлагатай мэдэгдэж буй эр бэлгийн эсийн уургийн аль нь ч илүүдэхгүй.
SPACA6 (болон IST супер гэр бүлийн бусад гишүүд) нь гаметик хоорондын уулзварт оролцож, чухал уургуудыг нэгтгэх цэгүүдэд элсүүлэхийн тулд интрагаметик сүлжээ үүсгэдэг, эсвэл бүр баригдашгүй фузогенийн үүрэг гүйцэтгэдэг эсэх нь нээлттэй асуулт хэвээр байна.HEK293T эсүүд дэх иммунопреципитацийн судалгаагаар бүрэн хэмжээний IZUMO1 болон SPACA632 хоорондын харилцан үйлчлэл илэрсэн.Гэсэн хэдий ч бидний рекомбинант эктодомайнууд in vitro-д харилцан үйлчилдэггүй байсан нь Noda нар дээр ажиглагдсан харилцан үйлчлэлийг харуулж байна.бүтээцэд хоёуланг нь устгасан (IZUMO1-ийн цитоплазмын сүүлийг анхаарна уу, энэ нь бордоонд шаардлагагүй болох нь тогтоогдсон62).Эсвэл IZUMO1 ба/эсвэл SPACA6 нь физиологийн өвөрмөц бүтэц, бусад уураг агуулсан (мэдэгдэж байгаа эсвэл хараахан нээгээгүй) молекулын цогцолбор гэх мэт бидний in vitro-д үржүүлдэггүй тусгай холбох орчныг шаардаж болно.Хэдийгээр IZUMO1 ectodomain нь перивителлин орон зайд эр бэлгийн эсийг өндөгтэй холбоход зуучилдаг гэж үздэг ч SPACA6 ectodomain-ийн зорилго тодорхойгүй байна.
SPACA6-ийн бүтэц нь уураг-уургийн харилцан үйлчлэлд оролцож болох хэд хэдэн хадгалагдсан гадаргууг илрүүлдэг.CXXC хээтэй шууд зэргэлдээх нугасны хэсгийн хадгалагдсан хэсэг (дээрх 1-р нөхөөсийг зааж өгсөн) нь гадагш чиглэсэн хэд хэдэн үнэрт үлдэгдэлтэй бөгөөд биомолекулуудын хооронд гидрофобик ба π-овоолох харилцан үйлчлэлтэй ихэвчлэн холбоотой байдаг.Ig төст домэйны өргөн талууд (2-р бүс) нь өндөр хадгалагдсан Арг ба Түүний үлдэгдэл бүхий эерэг цэнэгтэй ховил үүсгэдэг бөгөөд энэ бүсийн эсрэг эсрэгбие нь өмнө нь бэлгийн эсийн нэгдлийг блоклоход ашиглагдаж байсан 30 .Эсрэгбие нь 212RIRPAQLTHRGTFS225 шугаман эпитопыг таних бөгөөд энэ нь 6 аргинины үлдэгдлээс гурвыг нь агуулдаг бөгөөд маш сайн хадгалагдсан His220 юм.Эдгээр өвөрмөц үлдэгдэл эсвэл бүхэл бүтэн бүсийг бөглөрсөний улмаас үйл ажиллагаа доголдсон эсэх нь тодорхойгүй байна.β-сэндвичийн С төгсгөлийн ойролцоо энэ цоорхойн байрлал нь cis-харьцаж байгааг зэргэлдээ эр бэлгийн эсийн уурагтай харуулдаг боловч өндөгний уурагтай биш юм.Цаашилбал, нугасны дотор маш уян хатан пролинээр баялаг орооцолдох хэсэг (3-р сайт) нь уураг-уургийн харилцан үйлчлэлийн газар байж болно, эсвэл хоёр домэйны хооронд уян хатан байдал хадгалагдаж байгааг илтгэнэ.SPACA6-ийн үл мэдэгдэх үүргийн хувьд хүйс чухал.бэлгийн эсийн нэгдэл.
SPACA6 нь Ig-тэй төстэй β-сэндвич зэрэг эс хоорондын наалдац уургийн шинж чанартай байдаг.Олон тооны наалдамхай уураг (жишээлбэл, кадрин, интегрин, адгезин, IZUMO1) нь эсийн мембранаас уургийг хүрээлэн буй орчны зорилтууд руу сунгадаг нэг буюу хэд хэдэн β-сэндвич домайныг эзэмшдэг63,64,65.SPACA6-ийн Ig-тэй төстэй домайн нь наалдамхай ба нэгдлийн β-сэндвичүүдэд түгээмэл байдаг мотивийг агуулдаг: механик хавчаар гэж нэрлэгддэг β-сэндвичүүдийн төгсгөлд параллель судалтай давхар утаснууд66.Энэ сэдэл нь эс хоорондын харилцан үйлчлэлд оролцдог уургийн хувьд үнэ цэнэтэй, зүсэх хүчний эсэргүүцлийг нэмэгдүүлдэг гэж үздэг.Гэсэн хэдий ч наалдамхай бодистой ижил төстэй байдлыг үл харгалзан SPACA6 нь өндөгний цагаантай харилцан үйлчилдэг гэсэн нотолгоо одоогоор алга байна.SPACA6 ectodomain нь JUNO-тай холбогдох боломжгүй бөгөөд энд үзүүлсэн шиг SPACA6-г илэрхийлдэг HEK293T эсүүд нь 32-р бүсгүй өндөгтэй бараг харьцдаг.Хэрэв SPACA6 нь гаметик хоорондын холбоог бий болгодог бол эдгээр харилцан үйлчлэл нь орчуулгын дараах өөрчлөлт эсвэл бусад эр бэлгийн эсийн тогтворжилтыг шаарддаг.Сүүлчийн таамаглалыг батлахын тулд IZUMO1-ийн дутагдалтай spermatozoa нь өндөгний эсүүдтэй холбогддог нь IZUMO1-ээс бусад молекулууд бэлгийн эсийн наалдамхай үе шатанд оролцдог болохыг харуулж байна 27 .
Вирусын, эсийн болон хөгжлийн олон уургууд нь фузогенийн үүргийг урьдчилан таамаглах шинж чанартай байдаг.Жишээлбэл, вирусын нэгдэх гликопротеинууд (I, II, III ангиуд) нь уургийн төгсгөлд гидрофобик хайлуулах пептид эсвэл гогцоотой байдаг бөгөөд энэ нь эзэн мембранд ордог.IZUMO143-ийн гидрофилийн газрын зураг болон IST супер гэр бүлийн бүтэц (тодорхойлж, таамагласан) нь илэрхий гидрофобик хайлуулах пептидийг харуулаагүй.Тиймээс, хэрэв IST супер гэр бүлийн аливаа уураг нь фузогенийн үүрэг гүйцэтгэдэг бол тэдгээр нь үүнийг бусад мэдэгдэж буй жишээнүүдээс ялгаатай байдлаар гүйцэтгэдэг.
Дүгнэж хэлэхэд, бэлгийн эсийн нэгдэлтэй холбоотой уургийн IST супер гэр бүлийн гишүүдийн үүрэг нь нууцлаг хэвээр байна.Бидний онцлог шинж чанартай SPACA6 рекомбинант молекул ба түүний шийдэгдсэн бүтэц нь эдгээр хуваалцсан бүтцийн хоорондын хамаарал, бэлгийн эсийн хавсаргах, нэгдэх үүрэг ролийн талаар ойлголт өгөх болно.
Урьдчилан таамагласан хүний ​​SPACA6 эктодомайн (NCBI-ийн нэгдлийн дугаар NP_001303901.1; үлдэгдэл 27-246) харгалзах ДНХ-ийн дарааллыг Drosophila melanogaster S2 эсэд илэрхийлэхийн тулд кодоноор оновчтой болгож, генийн фрагмент болгон гезакурофины дараалалтай нэгтгэсэн., BiP шүүрлийн дохио ба харгалзах 5′ ба 3′ төгсгөлүүд нь пуромицин (pMT-puro)-тай сонгоход зориулж өөрчилсөн металлотионеин дэмжигч дээр суурилсан pMT экспрессийн вектор болгон энэ генийг холбохоос хамааралгүй клончлоход зориулагдсан.pMT-puro вектор нь тромбины задралын талбайн дараа 10x-His C-терминал тэмдэглэгээг кодлодог (Зураг S2).
SPACA6 pMT-puro векторыг D. melanogaster S2 (Gibco) эсүүд рүү тогтвортой шилжүүлэн суулгах ажлыг IZUMO1 ба JUNO43-д ашигласан протоколтой адил гүйцэтгэсэн.S2 эсийг гэсгээж, 10% (v/v) халуунд идэвхгүйжүүлсэн ургийн тугалын ийлдэс (Gibco) болон 1X антимикотик антибиотик (Gibco) агуулсан Шнайдерын тэжээлт орчинд (Гибко) ургуулсан.Эрт дамжих эсүүд (3.0 x 106 эсүүд) нь 6 худагтай хавтангийн бие даасан нүхэнд (Корнинг) бүрсэн байна.27°С-т 24 цагийн инкубацийн дараа эсийг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу 2 мг SPACA6 pMT-puro вектор ба Эффектен трансфекцийн урвалж (Qiagen)-ийн холимогоор шилжүүлэв.Шилжүүлсэн эсийг 72 цагийн турш өсгөвөрлөж, дараа нь 6 мг/мл пуромициноор цуглуулсан.Дараа нь эсүүдийг бүрэн Schneider-ийн орчноос тусгаарлаж, их хэмжээний уураг үйлдвэрлэх зорилгоор ийлдэсгүй Insect-XPRESS орчинд (Lonza) байрлуулсан.1 л багц S2 эсийн өсгөвөрийг 2 литр агааржуулалттай хавтгай ёроолтой полипропилен эрленэйрийн колбонд 8-10 × 106 мл-1 эс хүртэл өсгөж, дараа нь 500 мкМ CuSO4 (Millipore Sigma) эцсийн концентрациар ариутгаж, ариутгасан шүүсэн.өдөөгдсөн.Өсгөвөрлөсөн өсгөвөрийг дөрвөн өдрийн турш 27 ° C-т 120 эрг / мин-д өсгөвөрлөнө.
SPACA6 агуулсан нөхцөлт орчинг 5660хг-т 4°С-т центрифугийн аргаар, дараа нь 10 кДа MWCO мембран бүхий Centramate тангенциал урсгалын шүүлтүүрийн системийг (Pall Corp) тусгаарласан.2 мл Ni-NTA агароз давирхай (Qiagen) баганад SPACA6 агуулсан төвлөрсөн тэжээлийг түрхэнэ.Ni-NTA давирхайг 10 баганын эзэлхүүнтэй (CV) буфер А-аар угааж, дараа нь 1 CV буфер А нэмсэн имидазолын эцсийн концентраци 50 мМ болсон.SPACA6-г имидазол агуулсан 10 мл буфер А-аар 500 мМ эцсийн концентрацитай болгов.Хязгаарлалтын ангиллын тромбиныг (Millipore Sigma) диализийн хоолойд (MWCO 12-14 кДа) 1 нэгжээр SPACA6-ийн эсрэг 1 литр 10 мм Tris-HCl, рН 7.5 ба 150 мМ NaCl (буфер В)-тай шууд нэмсэн.) 40С-т 48 цагийн турш.Дараа нь тромбиноор хуваагдсан SPACA6-г давсны концентрацийг бууруулахын тулд гурав дахин шингэлж, 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5-тай тэнцвэржүүлсэн 1 мл MonoS 5/50 GL катион солилцооны баганад (Cytiva/GE) ачааллаа.Катион солилцогчийг 3 OK 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5, дараа нь SPACA6-г 0-500 мм NaCl-ийн шугаман градиентаар 10 мм Tris-HCl, рН 7.5 OK 25 OK-ээр угаана.Ион солилцооны хроматографийн дараа SPACA6-г 1 мл хүртэл баяжуулж, B буферээр тэнцвэржүүлсэн ENrich SEC650 10 x 300 баганаас (BioRad) изократ аргаар ялгаж авав. Хроматограммын дагуу SPACA6 агуулсан баяжмалын фракцууд.Цэвэршилтийг 16% SDS-полиакриламидын гель дээр Coomassie будсан электрофорезоор хянасан.Уургийн концентрацийг 280 нм долгионы долгионы долгионы шингээлтээр Beer-Lambert хууль болон онолын молийн унтрах коэффициент ашиглан хэмжсэн.
Цэвэршүүлсэн SPACA6-г 10 мМ натрийн фосфат, рН 7.4 ба 150 мМ NaF-ийн эсрэг нэг шөнийн дотор диализ хийж, CD спектроскопоор шинжилгээ хийхээс өмнө 0.16 мг/мл хүртэл шингэлсэн.185-аас 260 нм долгионы урттай CD-ийн спектрийн сканнерыг Jasco J-1500 спектрополяриметр дээр 1 мм-ийн оптик замын урттай (Хелма) кварц кювет ашиглан 25°С температурт 50 нм/мин хурдтайгаар цуглуулсан.CD-ийн спектрийг үндсэн шугамаар засч, 10 гаруй худалдан авалтыг дунджаар авч, см2/дмол градусаар дундаж үлдэгдэл эллипс (θMRE) болгон хувиргасан:
энд MW нь дээж бүрийн молекулын жин юм.N - амин хүчлийн тоо;θ нь милли градусаар илэрхийлэгдэх эллипс;d нь см-ийн оптик замын урттай тохирч байна;нэгж дэх уургийн агууламж.