347 12.7*1.24мм Зэвэрдэггүй ган ороомог хоолой, Синхрон электростатик конденсацын молекул механизм ба α-синуклеин ба tau-ийн коагрегация

Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.
Слайд бүрт гурван өгүүллийг харуулсан слайдерууд.Слайдуудын дундуур шилжихийн тулд буцах болон дараагийн товчлууруудыг, слайд бүрээр шилжихийн тулд төгсгөлд байрлах слайд хянагчийн товчлууруудыг ашиглана уу.

347 зэвэрдэггүй ган хоолойн тодорхойлолт

347 12.7*1.24мм Зэвэрдэггүй ган ороомогтой хоолой

Гаднах диаметр: 6.00 мм OD хүртэл 914.4 мм OD хүртэл, Хэмжээ нь 24” NB хүртэл боломжтой.

SS 347 хоолойн зузааны хүрээ: 0.3мм – 50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S гэх мэт (0.5-12мм) эсвэл ердийн бус хэмжээтэй, шаардлагатай бол тохируулна.

Төрөл: SS 347 үл үзэгдэх хоолой |SS 347 ERW хоолой |SS 347 Гагнасан хоолой |SS 347 үйлдвэрлэсэн хоолой |SS 347 CDW хоолой, LSAW хоолой / давхарга гагнаж / дахин зурсан

Маягт: SS 347 дугуй хоолой/ хоолой, SS 347 дөрвөлжин хоолой/ хоолой, SS 347 тэгш өнцөгт хоолой/ хоолой, SS 347 ороомог хоолой, SS 347 "U" хэлбэр, SS 347 тогоо бялуу, SS 347 гидравлик хоолой

Урт: Нэг санамсаргүй, давхар санамсаргүй, шаардлагатай урт: энгийн төгсгөл, налуу төгсгөл, дэвссэн төгсгөл

Төгсгөлийн хамгаалалт: Хуванцар таг |Гаднах өнгөлгөө: Зэвэрдэггүй ган хоолойн 2В, №4, №1, №8 тольны өнгөлгөө, хэрэглэгчийн шаардлагын дагуу өнгөлгөө

Хүргэлтийн нөхцөл: шатаасан, даршилсан, өнгөлсөн, тод шарсан, хүйтэн татсан

Хяналт шалгалт, Туршилтын тайлан: Тээрмийн туршилтын гэрчилгээ, EN 10204 3.1, Химийн тайлан, Механик тайлан, PMI туршилтын тайлан, Харааны хяналтын тайлан, Гуравдагч этгээдийн хяналтын тайлан, NABL батлагдсан лабораторийн тайлан, Үл эвдэх туршилтын тайлан, Үл эвдэх туршилтын тайлан

Сав баглаа боодол: Модон хайрцаг, хуванцар уут, ган туузыг багцалсан эсвэл үйлчлүүлэгчийн хүсэлтийн дагуу савласан

Онцлог: Дээрхээс бусад хэмжээ, үзүүлэлтүүдийг хүсэлтээр үйлдвэрлэж болно

SS 347 хоолойны хэмжээ: 1/2 инчийн NB, OD-аас 24 инч хүртэл

ASTM A312 347: Өндөр температур, ерөнхий идэмхий үйлчилгээнд зориулагдсан гагнуургүй, шулуун давхаргатай аустенит хоолой.Гагнуурын үед дүүргэгч металлыг зөвшөөрдөггүй.

ASTM A358 347: Идэмхий болон/эсвэл өндөр температурт үйлчлэх цахилгаан хайлуулах гагнасан аустенит хоолой.Ихэвчлэн энэ үзүүлэлтийн дагуу зөвхөн 8 инч хүртэлх хоолойг үйлдвэрлэдэг.Гагнуурын явцад дүүргэгч метал нэмэхийг зөвшөөрнө.

ASTM A790 347: Стресс зэврэлтээс үүсэх хагарлыг тэсвэрлэхэд онцгой анхаарал хандуулсан, ерөнхий зэврэлтэнд зориулагдсан феррит/аустенит (дуплекс) гагнасан шулуун давхаргатай хоолой.

ASTM A409 347: Шулуун эсвэл спираль давхаргын цахилгаан хайлуулж гагнасан том диаметртэй аустенит хөнгөн хананы хоолой, 14-30 инчийн хэмжээтэй, Sch5S ба Sch 10S ханатай, идэмхий ба/эсвэл өндөр

ASTM A376 347: Өндөр температурт хэрэглэх зориулалттай үл үзэгдэх аустенит хоолой.

ASTM A813 347: Өндөр температур ба ерөнхий идэмхий хэрэглээнд зориулагдсан нэг давхарга, нэг эсвэл хоёр гагнасан аустенит хоолой.

ASTM A814 347: Хүйтэн аргаар боловсруулсан гагнасан аустенит хоолой, өндөр температур, ерөнхий идэмхий үйлчилгээтэй.

347H зэвэрдэггүй ган хоолойн химийн найрлага

Зэвэрдэггүй ган 347H хоолойн механик шинж чанар

Зэвэрдэггүй ган 347H хоолойн физик шинж чанар

347H зэвэрдэггүй ган хоолойн эквивалент зэрэглэл

Амилоид альфа-синуклеины (αS) нэгдэл нь Паркинсоны өвчин болон бусад синуклеинопати өвчний шинж тэмдэг юм.Сүүлийн үед Альцгеймерийн өвчинтэй ихэвчлэн холбоотой байдаг тау уураг нь αS-ийн эмгэгтэй холбоотой байсан бөгөөд αS-ээр баялаг найрлагад нэгдмэл байршдаг болох нь тогтоогдсон ч хоёр уургийн бүлэгнэлтийн молекулын механизм тодорхойгүй хэвээр байна.αS фаз нь tau гэх мэт эерэг цэнэгтэй полипептидүүдтэй электростатик цогцолбор конденсацаар шингэн конденсат болж хуваагддаг гэдгийг бид энд мэдээлж байна.αS-ийн поликатионуудын хамаарал болон коагуляцийн сүлжээний валентийн хомсдолын хурдаас хамааран өтгөрөлт нь хурдан желеаци эсвэл нэгдэж, дараа нь амилоид агрегация удаан явагддаг.Биофизикийн дэвшилтэт аргуудыг нэгтгэснээр бид шингэн-шингэн αS/Tau фазын салангид чанарыг тодорхойлж, шингэн уургийн конденсат дахь хоёр уураг агуулсан нэг төрлийн бус агрегатууд үүсэхэд хүргэдэг гол хүчин зүйлсийг тодорхойлж чадсан.
Мембран тасалгаанаас гадна эс дэх орон зайн тусгаарлалтыг шингэн-шингэн фазын тусгаарлалт (LLPS) гэж нэрлэгддэг процессоор дамжуулан биомолекулын конденсат буюу дусал гэж нэрлэгддэг уурагаар баялаг, шингэн шиг нягт биетүүдийг бий болгож болно.Эдгээр дуслууд нь ихэвчлэн уураг эсвэл уураг, РНХ-ийн хоорондох олон валентын түр зуурын харилцан үйлчлэлийн үр дүнд үүсдэг бөгөөд бараг бүх амьд системд янз бүрийн үүрэг гүйцэтгэдэг.Олон тооны LLP-ийн чадвартай уургууд нь маш эмх замбараагүй шинж чанартай, биомолекулын конденсат 3,4,5 үүсэх бага төвөгтэй дарааллыг харуулдаг.Олон тооны туршилтын судалгаанууд эдгээр шингэн хэлбэрийн конденсатыг бүрдүүлдэг уургийн уян хатан, ихэвчлэн эмх замбараагүй, олон валент шинж чанарыг олж илрүүлсэн боловч эдгээр конденсатуудын өсөлт, боловсорч гүйцэх явцыг хянадаг тодорхой молекулын тодорхойлогчдын талаар бага мэддэг. муж..
Шинэ өгөгдлүүд нь хэвийн бус уургаар удирддаг LLPS болон дуслыг хатуу бүтэц болгон хувиргах нь ихэвчлэн дегенератив өвчний шинж тэмдэг болох уусдаггүй хорт бодис үүсэхэд хүргэдэг эсийн холбогдох зам байж болох гэсэн таамаглалыг дэмжиж байна.LLPS-тэй холбоотой олон дотоод эмх замбараагүй уургууд (IDPs), ихэвчлэн өндөр цэнэгтэй, уян хатан байдаг нь амилоид нэгтгэх үйл явцаар мэдрэлийн доройтолтой холбоотой байдаг.Ялангуяа FUS7 эсвэл TDP-438 гэх мэт биомолекулын IDP конденсатууд эсвэл hnRNPA19 гэх мэт нарийн төвөгтэй байдал багатай уураг нь шингэнжилт гэж нэрлэгддэг процессоор гель шиг эсвэл бүр хатуу хэлбэрт шилждэг.нэгдэл.хатуу фазын шилжилт (LSPT) нь цаг хугацааны функц эсвэл орчуулгын дараах өөрчлөлтүүд эсвэл эмгэгийн ач холбогдолтой мутацийн хариу үйлдэл юм1,7.
In vivo LLPS-тэй холбоотой өөр нэг IDP бол микротубултай холбоотой эмх замбараагүй уураг болох Тау бөгөөд амилоид агрегация нь Альцгеймерийн өвчинд10 нөлөөлсөн боловч саяхан Паркинсоны өвчин (PD) болон бусад синаптик цөмийн протеинопати 11, 12, 13-тай холбоотой байдаг.Тау нь эерэг цахилгаан статик харилцан үйлчлэлийн14 улмаас уусмал/цитоплазмаас аяндаа салж, улмаар электростатик коацерват гэж нэрлэгддэг таугаар баяжуулсан дуслууд үүсдэг.Мөн энэ төрлийн өвөрмөц бус харилцан үйлчлэл нь байгальд олон биомолекулын конденсат үүсэх хөдөлгөгч хүч болдог нь ажиглагдсан15.Тау уургийн хувьд уургийн эсрэг цэнэгтэй хэсгүүд нь задралын процессыг өдөөдөг энгийн нэгдэл, эсвэл РНХ зэрэг сөрөг цэнэгтэй полимеруудтай харилцан үйлчлэлцэх замаар нийлмэл нэгтгэх замаар электростатик агрегацийг үүсгэж болно.
Саяхан α-синуклеин (αS) нь синуклеинопати17,18 гэгддэг PD болон бусад мэдрэлийн дегенератив өвчинд нөлөөлдөг амилоид IDP нь шингэнтэй төстэй уургийн конденсатт төвлөрч, эсийн болон амьтны загварт 19,20 харуулж байна.In vitro судалгаагаар αS нь ихэвчлэн гидрофобик харилцан үйлчлэлээр дамжуулан LLPS-ийг энгийн нэгтгэх замаар явуулдаг болохыг харуулсан боловч энэ процесс нь уургийн онцгой өндөр концентраци, хэвийн бус урт инкубацийн хугацаа шаарддаг19,21.Vivo-д ажиглагдсан αS агуулсан конденсатууд нь энэ эсвэл бусад LLPS процессоор үүссэн эсэх нь шийдэгдээгүй гол асуудал хэвээр байна.Үүний нэгэн адил, PD болон бусад синуклеинопатийн мэдрэлийн эсүүдэд αS амилоид бөөгнөрөл ажиглагдсан боловч αS нь эсийн доторх амилоид бөөгнөрөл үүсэх механизм нь тодорхойгүй хэвээр байгаа бөгөөд энэ уургийн хэт их илэрхийлэл нь энэ процессыг өөрөө өдөөдөггүй.Ихэнхдээ эсийн нэмэлт гэмтэл шаардлагатай байдаг бөгөөд энэ нь эсийн доторх αS амилоид угсралтыг нөхөн сэргээхэд тодорхой эсийн байршил эсвэл бичил орчин шаардлагатай байгааг харуулж байна.Ялангуяа бөөгнөрөлд өртөмтгий эсийн нэг орчин нь уургийн конденсат 23-ын дотоод хэсэг байж болно.
Сонирхолтой нь, αS ба tau нь Паркинсоны өвчин болон бусад синуклеинопатитай хүний ​​өвөрмөц өвчний нэгдлүүдэд хамт байршдаг болох нь тогтоогдсон 24,25 ба туршилтаар хоёр уургийн хооронд синергетик эмгэгийн хамаарал байгааг мэдээлсэн 26,27 нь αS ба тау нэгтгэх хоорондын боломжит хамаарлыг харуулж байна. мэдрэлийн доройтлын өвчинд tau.өвчлөл.αS ба tau нь харилцан үйлчилж, бие биенийхээ нэгтгэлийг in vitro болон in vivo 28,29, синуклеинопатитай өвчтөнүүдийн тархинд эдгээр хоёр уургаас бүрдсэн гетероген агрегатууд ажиглагдсан 30.Гэсэн хэдий ч αS ба tau-ийн харилцан үйлчлэлийн молекулын үндэс, түүнийг нэгтгэх механизмын талаар бага зүйл мэддэг.αS нь эерэг цэнэгтэй үлдэгдэлээр баяжуулсан αS-ийн өндөр сөрөг цэнэгтэй С-терминал ба төв пролинээр баялаг tau бүсийн хооронд электростатик таталтаар дамжуулан tau-тай харилцан үйлчилдэг гэж мэдээлсэн.
Энэ судалгаагаар αS нь поли-L-лизин (pLK) зэрэг бусад эерэг цэнэгтэй полипептидүүдтэй харилцан үйлчлэлцэхээс ялгаатай нь tau уургийн оролцоотойгоор электростатик конденсацын замаар дусал болон задрах боломжтой болохыг харуулж байна.αS нь дуслын сүлжээний тулгуур молекулын үүргийг гүйцэтгэдэг.Бид электростатик αS коацерватуудын боловсорч гүйцэх үйл явцын мэдэгдэхүйц ялгааг олж тогтоосон бөгөөд энэ нь коацерват сүлжээнд оролцдог уургийн харилцан үйлчлэлийн валент ба хүч чадлын ялгаатай холбоотой байдаг.Сонирхолтой нь, бид урт насалдаг шингэн коацерват дахь αS ба tau амилоид уургуудын нэгдмэл байдлыг ажиглаж, эдгээр хоёр уургийг ийм коацерватт нэгтгэхэд хүргэдэг зарим гол хүчин зүйлийг тодорхойлсон.Энд бид энэ үйл явцыг нарийвчлан тайлбарласан бөгөөд энэ нь өвчний өвөрмөц найрлага дахь хоёр уургийн нэгдлүүдийн суурь болох молекулын механизм юм.
αS нь төвийг сахисан рН (Зураг 1a) дээр өндөр анион С-терминал сүүлтэй бөгөөд энэ нь поликатион эмх замбараагүй полипептидийн молекулуудтай электростатик цогцолборыг конденсацлах замаар LLPS-д орж болно гэж бид таамагласан.Бид 100 үлдэгдэлтэй поли-Л-лизин (pLK)-ийг саармаг рН 32-д эерэг цэнэгтэй, эмх замбараагүй полимер шинж чанартай тул эхлэл загвар молекул болгон ашигласан. Нэгдүгээрт, pLK нь αS-ийн Ct мужтай харьцаж байгааг Уусмалын NMR спектроскопоор баталгаажуулсан. (Зураг 1б) αS:pLK молийн харьцаа нэмэгдэж байгаа үед 13C/15N-шошготой αS-г ашиглана.pLK-ийн αS-ийн Ct-домэйнтэй харилцан үйлчлэлцэх нь химийн шилжилтийн хямрал, уургийн энэ бүсэд оргил эрчимжилт буурах замаар илэрдэг.Сонирхолтой нь, бид αS-ийг pLK-тэй αS концентрацитай хольсон үед ойролцоогоор.Полиэтилен гликол (5-15% PEG-8) байгаа тохиолдолд 5-25 мкм (ердийн LLPS буфер: 10 мм HEPES рН 7.4, 100 мМ NaCl, 15% PEG-8) бид тэр даруй уураг үүсэх өргөн талбарыг туулсан. .флюресценц (WF) болон тод талбайн (BF) микроскоп ашиглан дуслуудыг ажиглав (Зураг 1c).Төвлөрсөн αS агуулсан 1-5 μм дусал (1 μM AlexaFluor488 шошготой αS, AF488-αS нэмсэн), тэдгээрийн цахилгаан статик шинж чанарыг 10% 1,6-гексанедиол (1,6-HD)-д тэсвэртэй байдал, мэдрэмтгий байдлаас нь авч болно. NaCl концентрацийн өсөлт (Зураг 1c).αS/pLK электростатик цогцолборын коацерватуудын шингэнтэй төстэй шинж чанар нь миллисекундэд нэгдэх чадвараар нотлогддог (Зураг 1d).Турбидиметрийг ашиглан бид эдгээр нөхцөлд дусал үүсэхийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлж, түүний тогтвортой байдалтай холбоотой үндсэн харилцан үйлчлэлийн электростатик шинж чанарыг баталгаажуулсан (Зураг 1e), LLPS процесст янз бүрийн полимер харьцааны нөлөөг үнэлэв (Зураг 1f).Хэдийгээр олон төрлийн полимер харьцаагаар дусал үүсэх нь ажиглагдаж байгаа ч pLK αS-ээс их байвал процесс нь маш таатай байдаг.LLP нь химийн хувьд ялгаатай декстран-70 (70 кДа) эсвэл шилний гулсуур, янз бүрийн материалын микроплит худаг, Эппендорф эсвэл кварцын хялгасан судас зэрэг янз бүрийн дээжийн форматыг ашиглан ажиглагдсан.
Энэхүү судалгаанд ашигласан WT-αS ба ΔCt-αS хувилбаруудын өөр өөр уургийн бүсүүдийн бүдүүвч дүрслэл.Амфипатик N-терминал домэйн, гидрофобик амилоид үүсгэгч (NAC) бүс, сөрөг цэнэгтэй С-терминал домэйныг хөх, улбар шар, улаан өнгөөр ​​тус тус үзүүлэв.WT-αS-ийн Net Charge Per Residual (NCPR) газрын зургийг үзүүлэв.б Макромолекулын бөөгнөрөл байхгүй үед αS/pLK харилцан үйлчлэлийн NMR шинжилгээ.pLK концентраци нэмэгдэх тусам (αS:pLK молийн харьцаа 1:0.5, 1:1.5, 1:10-ыг цайвар ногоон, ногоон, хар ногоон өнгөөр ​​тус тус үзүүлэв).c αS/pLK (молийн харьцаа 1:10) -ийг LLPS буферт (дээд талд) эсвэл 500 мМ NaCl эсвэл дараа нь (доод талд) 25 μM (1 μM AF488 шошготой αS эсвэл WF дүрслэлд зориулсан Atto647N шошготой pLK) коасерватжуулна. % 1,6-гександиол (1,6-HD; баруун доод талд).Хуваарийн мөр = 20 мкм.d 25 мкМ концентрацитай αS/pLK (молийн харьцаа 1:10)-ийн BF дуслын нэгдлүүдийн микроскопийн төлөөлөл;сумнууд нь 200 мс дотор тус тусын дуслыг (улаан ба шар сум) шинэ дусал (улбар шар сум) болгон нэгтгэж байгааг харуулж байна).Хуваарийн мөр = 20 мкм.e Гэрлийн тархалт (350 нм-д) 500 mM NaCl эсвэл 10% 1,6-HD 25 μM αS-д нэмэхээс өмнө болон дараа LLPS буферт αS/pLK нэгтгэх (N = 3 дээжийн хуулбар, дундаж болон стандарт хазайлтыг мөн зааж өгсөн).f BF дүрс (дээд) ба гэрлийн сарнилын шинжилгээ (350 нм, доод хэсэгт) αS/pLK нийлбэрийн 25 μM αS-д αS: pLK молийн харьцаа нэмэгдэж байгаа (N = 3 дээжийн хуулбар, дундаж болон стандарт хазайлтыг мөн зааж өгсөн).Хуваарийн мөр = 10 мкм.Нэг зураг дээрх масштабын талбар нь нэг самбар дахь бүх зургийн масштабыг заана.Түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
αS/pLK электростатик нийлмэл конденсацын талаарх бидний ажиглалт болон tau31-тэй шууд харилцан үйлчлэлцэх замаар tau/РНХ-ийн конденсатын үйлчлүүлэгч молекул болох αS-ийн өмнөх ажиглалтууд дээр үндэслэн РНХ байхгүй үед αS ба tau нь уусгагчтай хамт ялгарч чадна гэсэн таамаглал дэвшүүлсэн. конденсац.электростатик цогцолборуудаар дамжих ба αS нь αS/Tau коацерват дахь шатын уураг юм (Зураг 2e-ийн tau цэнэгийн тархалтыг харна уу).LLPS буферт 10 μM αS ба 10 μM Tau441 (1 μM AF488-αS ба 1 μM Atto647N-Tau тус тус агуулсан) холилдох үед WF-ийн микроскопоор харахад тэдгээр нь хоёр уураг агуулсан уургийн агрегатуудыг амархан үүсгэдэг болохыг бид ажигласан.(Зураг 2a).Дусал дахь хоёр уургийн колокализаци нь конфокаль (CF) микроскопоор батлагдсан (Нэмэлт зураг 1a).Декстран-70-ийг нэгтгэх бодис болгон ашиглах үед ижил төстэй байдал ажиглагдсан (Нэмэлт зураг 1c).FITC шошготой PEG эсвэл декстраныг ашиглан бид бөөгнөрөгч бодис хоёулаа дээжинд жигд тархсан бөгөөд тусгаарлалт, холбоог харуулаагүй болохыг олж мэдсэн (Нэмэлт зураг 1d).Үүний оронд энэ системд тэдгээр нь макромолекулын бөөгнөрөл нөлөөгөөр фаз тусгаарлалтыг дэмждэг гэж үздэг, учир нь PEG нь бусад LLP системүүдээс харагддаг33,34 илүү тогтвортой бөөгнөрөгч бодис юм.Эдгээр уургаар баялаг дуслууд нь NaCl (1 M) -д мэдрэмтгий байсан боловч 1,6-HD (10% v/v) -д мэдрэмтгий биш байсан нь тэдний электростатик шинж чанарыг баталж байна (Нэмэлт зураг 2a, b).Тэдний шингэний зан төлөвийг BF микроскоп ашиглан миллисекунд нийлсэн дуслын үйл явдлыг ажигласнаар батлагдсан (Зураг 2b).
a LLPS буфер дэх αS/Tau441 коацерватуудын конфокаль (CF) микроскопийн зураг (уураг тус бүрээс 10 мкм, AF488 шошготой αS ба Atto647N шошготой Tau441 0.5 мкм).b αS/Tau441 дуслын нэгдлийн үйл явдлын төлөөллийн дифференциал интерференцийн тодосгогч (DIC) зураг (уураг тус бүрд 10 μM).c Tau441 LLPS (0–15 μM) 50 μM αS байхгүй (зүүн) эсвэл байгаа (баруун) үед гэрлийн тархалт (350 нм-д) дээр суурилсан фазын диаграмм.Дулаан өнгө нь илүү их тархалтыг илтгэнэ.d αS/Tau441 LLPS дээжийн αS концентраци ихсэх үед гэрлийн тархалт (5 μM-д Tau441, N = 2-3 дээжийн давталт заасны дагуу).e Энэхүү судалгаанд ашигласан зарим тау уургийн хувилбарууд болон уургийн өөр өөр бүсүүдийн бүдүүвч дүрслэл: сөрөг цэнэгтэй N-терминал домэйн (улаан), пролинээр баялаг бүс (цэнхэр), микро гуурсан хоолойг холбох домэйн (МТБД, улбар шараар тодруулсан) болон амилоид үүсгэгч хос спираль.MTBD (саарал) дотор байрлах судлын бүсүүд (PHF).Tau441-ийн Net Charge Per Residue (NCPR) газрын зургийг үзүүлэв.f ΔNt-Tau (дээд, уураг тутамд 10 μМ) эсвэл K18 (доод, нэг уураг тутамд 10 μM) байгаа тохиолдолд 1 μM AF488 шошготой αS ба Atto647N шошготой ΔNt-, 1 μM AF488 шошготой αS эсвэл ΔCt-αS ашиглан )) ) LLPS буюу K18 буферт хураангуйлсан WF-ийн микрографик.Нэг зургийн масштабын баар нь нэг самбар дахь бүх зургийн масштабыг илэрхийлнэ (a, b, f самбарт 20 микрон).c ба d самбаруудын түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгсөн.
Энэхүү LLPS процесст αS-ийн үүргийг шалгахын тулд бид эхлээд NaCl-ийн концентрацийг нэмэгдүүлэх замаар нефелометрийн аргаар αS-ийн дуслын тогтвортой байдалд үзүүлэх нөлөөг судалсан (Зураг 2c).αS агуулсан дээж дэх давсны агууламж өндөр байх тусам гэрлийн тархалтын утга (350 нм-д) өндөр байх тусам энэ LLPS систем дэх αS тогтворжуулах үүргийг харуулж байна.Үүнтэй төстэй нөлөөг αS-ийн концентрацийг (мөн αS: Tau441 харьцаа) ойролцоогоор нэмэгдүүлэх замаар ажиглаж болно.Тау концентрацитай харьцуулахад 10 дахин нэмэгддэг (5 μM) (Зураг 2d).αS нь коацерват дахь шатын уураг гэдгийг харуулахын тулд бид ΔNt-Tau гэж нэрлэгддэг сөрөг цэнэгтэй N-терминал бүс (үлдэгдэл 1-150, Зураг 2e) байхгүй, LLPS-ийн тасалдсан Тау мутантуудын зан байдлыг судлахаар шийдсэн.WF-ийн микроскоп ба нефелометрийн шинжилгээгээр ΔNt-Tau өөрөө LLPS-д ороогүй болохыг баталсан (Зураг 2f ба Нэмэлт зураг 2d) өмнө нь мэдээлсэн 14. Гэсэн хэдий ч энэхүү таслагдсан Тау хувилбарын дисперсийн уусмалд αS нэмэхэд LLPS процесс бүрэн дууссан байна. ижил төстэй нөхцөл, уургийн концентрацитай Tau ба αS-ийн бүрэн хэмжээний уусмалын дуслын нягттай ойролцоо дуслын нягтаар сэргээгдсэн.Энэ үйл явцыг макромолекулын бөөгнөрөл багатай нөхцөлд ажиглаж болно (Нэмэлт зураг 2c).(ΔCt-) 104-140 (Зураг 1а) үлдэгдэлгүй C-терминалын тайрсан αS хувилбарыг ашиглан дусал үүсэхийг дарангуйлах замаар LLPS процесст C-терминал αS бүсийн гүйцэтгэх үүргийг харуулсан боловч түүний бүхэл бүтэн урт нь биш юм. αS) уураг (Зураг 2f ба Нэмэлт зураг 2d).αS ба ΔNt-Tau-ийн нэгдмэл байдлыг конфокаль флюресцент микроскопоор баталгаажуулсан (Нэмэлт Зураг 1b).
Tau441 ба αS-ийн хоорондох LLPS механизмыг цаашид туршихын тулд нэмэлт Tau хувилбарыг ашигласан, тухайлбал, микро гуурсан холболтын домэйн (MTBD) дахь хосолсон мушгиа судалтай цөм (PHF) фрагмент бөгөөд хэрвээ энэ нь дөрвөн давтагдах домэйныг агуулдаг бол түгээмэл хэрэглэгддэг. K18 хэлтэрхий (2e-р зургийг үз).Саяхан αS нь пролинээр баялаг домэйнд байрлах тау уурагтай микро гуурсан хоолойноос өмнөх дарааллаар холбогддог гэж саяхан мэдээлсэн.Гэсэн хэдий ч PHF бүс нь эерэг цэнэгтэй үлдэгдэл (Зураг 2e-г үзнэ үү), ялангуяа лизин (15% үлдэгдэл) -ээр баялаг бөгөөд энэ бүс нь αS/Tau цогцолборын конденсацид нөлөөлж байгаа эсэхийг шалгахад түлхэц болсон.Туршилтын нөхцөлд (15% PEG эсвэл 20% декстран бүхий LLPS буфер) K18 дангаараа LLPS-ийг 100 μM хүртэлх концентрацид үүсгэж чадахгүй байгааг бид ажигласан (Зураг 2f).Гэсэн хэдий ч бид 50 μM αS-г 50 μM K18-д нэмэхэд K18 ба αS агуулсан уургийн дусал хурдан үүсэхийг нефелометрийн (Нэмэлт зураг 2d) болон WF микроскопоор (Зураг 2f) ажиглав.Хүлээгдэж буйчлан ΔCt-αS нь K18-ийн LLPS-ийн зан төлөвийг сэргээж чадаагүй (Зураг 2f).αS/K18-ийн нэгдэл нь αS/ΔNt-Tau эсвэл αS/Tau441-тэй харьцуулахад LLPS-ийг өдөөхөд бага зэрэг өндөр уургийн концентрацийг шаарддаг гэдгийг бид тэмдэглэж байна.Энэ нь αS C-терминалын бүсийн пролинээр баялаг Тау домэйнтэй микротубулыг холбогч домэйнтэй харьцуулахад илүү хүчтэй харилцан үйлчлэлтэй нийцэж байгаа бөгөөд өмнө нь тайлбарласан 31 .
ΔNt-Tau нь αS байхгүй үед LLPS-ийг гүйцэтгэх боломжгүй гэдгийг харгалзан бид бүрэн хэмжээний Tau (изотип, Tau441/Tau441) бүхий LLPS системд хялбар байдгийг харгалзан αS/Tau LLPS-ийг тодорхойлох загвар болгон энэхүү Tau хувилбарыг сонгосон.нарийн төвөгтэй (гетеротип, αS/Tau441) нэгтгэх процессуудтай.Бид αS/Tau ба αS/ΔNt-Tau систем дэх αS нэгтгэлийн түвшинг (өтгөрүүлсэн фазын уургийн нэг хэсэг болох fαS,c) центрифуг болон тархсан фазын SDS-PAGE шинжилгээгээр (2e-г үзнэ үү) харьцуулж, маш төстэй утгыг олсон. ижил концентрацитай бүх уургийн хувьд.Ялангуяа αS/Tau ба αS/ΔNt-Tau-ийн хувьд бид fαS,c 84 ± 2% ба 79 ± 7%-ийг тус тус авсан нь αS ба tau-ийн гетеротип харилцан үйлчлэл нь tau молекулуудын харилцан үйлчлэлээс илүү байгааг харуулж байна.хооронд.
Төрөл бүрийн поликатуудын харилцан үйлчлэл ба конденсацийн үйл явцын αS кинетикт үзүүлэх нөлөөг эхлээд фото цайруулах (FRAP) аргаар флюресценцийг сэргээх аргаар судалсан.Бид αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau болон αS/pLK коацерватуудыг туршсан (100 μM αS нь 2 μM αS AF488-αS ба 100 μM Tau441 эсвэл ΔNt-Tau буюу 1 mM pLK-ээр нэмэгддэг).Мэдээллийг дээжийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг хольсны дараа эхний 30 минутын дотор олж авсан.Төлөөлөгч FRAP зураг (Зураг 3a, αS/Tau441 конденсаци) болон тэдгээрийн харгалзах хугацааны муруй (Зураг 3b, Нэмэлт зураг 3) -аас αS кинетик нь Tau441 коацерватуудынхтай маш төстэй болохыг харж болно.болон ΔNt-Tau, энэ нь pLK-тэй хамаагүй хурдан байдаг.FRAP-ийн дагуу коацерват доторх αS-ийн тархалтын тооцоолсон коэффициентүүд (Kang нар 35-ын тайлбарласнаар) αS/Tau441 ба α-S/Δt-ийн хувьд D = 0.013 ± 0.009 μm2/s, D = 0.026 ± 0.008 µm2/s байна. αS/ систем.pLK, Tau ба D = 0.18 ± 0.04 μm2 / с тус тус (Зураг 3c).Гэсэн хэдий ч дисперс фаз дахь тархалтын коэффициент αS нь ижил нөхцөлд (LLPS буфер) боловч поликатион байхгүй үед Флуоресценцийн корреляцийн спектроскопоор (FCS, Нэмэлт зураг 3-ыг үзнэ үү) тодорхойлсноор бүх конденсацлагдсан фазуудаас хэд хэдэн дарааллаар өндөр байна. (D = 8 ± 4 мкм2/с).Иймээс αS орчуулгын кинетик коацерватуудад тархсан фаз дахь уургуудтай харьцуулахад илт молекулын бөөгнөрөлтэй нөлөөгөөр мэдэгдэхүйц буурдаг боловч бүх коацерватууд үүссэнээс хойшхи эхний хагас цагийн туршид tau фазаас ялгаатай нь шингэн шинж чанарыг хадгалдаг.pLK конденсат дахь илүү хурдан кинетик.
a–c Электростатик коацерват дахь αS динамикийн (2% AF488 шошготой αS) FRAP шинжилгээ.αS/Tau441 FRAP шинжилгээний гурвалсан зургийг (a)-д үзүүлэв, улаан хүрээнүүд нь өнгөө алдсан хэсгийг илтгэнэ.Хэмжээний бар нь 5 микрон байна.b 100 μM αS ба Tau441 (улаан) эсвэл ΔNt-Tau (цэнхэр) эсвэл pLK (ногоон) -ын эквимоляр концентрацийг ашигласан гурван туршилтаас 5-6 (N) өөр дусал дуслын дундаж FRAP муруй ба (в) тооцоолсон тархалтын коэффициент (D) LLPS-ийн агууламжаас арав дахин их.FRAP муруйн стандарт хазайлтыг сүүдэртэй өнгөөр ​​харуулав.Харьцуулахын тулд сарнисан үе дэх тархалтын коэффициент αS-ийг флюресценцийн корреляцийн спектроскопи (FCS) ашиглан гурвалсан хэлбэрээр тодорхойлсон (нэмэлт мэдээлэл авахыг хүсвэл 3-р зураг болон аргуудыг үзнэ үү).d LLPS буфер дэх 100 μM TEMPOL-122-αS-ийн тасралтгүй X зурвасын EPR спектрүүд ямар ч поликатиацгүй (хар) эсвэл 100 μM Tau441 (улаан) эсвэл ΔNt-Tau (цэнхэр) эсвэл 1 мМ pLK (ногоон) байгаа тохиолдолд.Дотор нь хамгийн эрс өөрчлөлт гарсан хүчтэй талбайн шугамын томруулсан зургийг харуулж байна.e LLPS байхгүй үед янз бүрийн поликатууд бүхий 50 μM TEMPOL-122-αS-ийн холбох муруйнууд (PEG байхгүй).Нормалжуулсан EPR спектрийн II (III/III) зурвастай харьцуулахад III зурвасын далайц багассан нь Tau441 (улаан), ΔNt-Tau (цэнхэр) болон pLK (ногоон) молийн харьцааг ихэсгэж байгааг харуулж байна.Өнгөт шугамууд нь муруй бүр дээр n ижил, бие даасан холбох газар бүхий бүдүүлэг холбох загварыг ашиглан өгөгдөлд тохирохыг харуулдаг.Түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
Нэмэлт болгон бид чиглүүлсэн эргэлтийн шошго (SDSL) болон тасралтгүй электрон парамагнит резонансын (CW-EPR) ашиглан янз бүрийн коацерват дахь αS-ийн динамикийг судалсан.Энэ арга нь IDP-ийн уян хатан байдал, динамикийг бодитой үлдэгдэл нарийвчлалтайгаар тайлагнахад маш ашигтай болох нь батлагдсан36,37,38.Үүний тулд бид дан Cys мутантуудад цистеины үлдэгдлийг үүсгэж, 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) спирин мэдрэгчийг ашигласан.Малеймидын деривативууд тэдгээрийг тэмдэглэдэг.Тодруулбал, бид TEMPOL мэдрэгчийг 122 эсвэл 24 αS (TEMPOL-122-αS ба TEMPOL-24-αS) байрлалд оруулсан.Эхний тохиолдолд бид поликатуудтай харилцан үйлчлэлд оролцдог уургийн С-терминал мужийг чиглүүлдэг.Үүний оронд 24-р байрлал нь конденсат дахь уургийн ерөнхий динамикийн талаар мэдээлэл өгөх боломжтой.Аль ч тохиолдолд тархсан фазын уургийн хувьд олж авсан EPR дохио нь хурдан хөдөлж буй төлөвт байгаа нитроксидын радикалуудтай тохирч байв.Tau эсвэл pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 эсвэл ΔNt-Tau 1:1 харьцаатай эсвэл pLK 1:10 харьцаатай) байгаа үед фазыг салгасны дараа харьцангуй оргил эрчмийн өсөлт ажиглагдсан. αS-ийн EPR спектр.Алдагдлын шугам өргөссөн нь шингэрүүлсэн үе дэх уурагтай харьцуулахад дусал дахь αS чиг баримжаа буурах кинетикийг харуулж байна (Зураг 3d, Нэмэлт зураг 4a).Эдгээр өөрчлөлтүүд 122-р байрлалд илүү тод харагдаж байна. 24-р байрлалд pLK байгаа нь датчикийн кинетикт нөлөөлөөгүй бол 122-р байрлалд спектрийн шугамын хэлбэр мэдэгдэхүйц өөрчлөгдсөн (Нэмэлт зураг 4a).Бид спин-шошготой IDP38,39-ийн динамикийг тодорхойлоход түгээмэл хэрэглэгддэг изотроп загварыг (Нэмэлт Зураг 5a) ашиглан хоёр αS/поликацийн системийн 122-р байрлал дахь спектрийг загварчлахыг оролдох үед туршилтын спектрийг сэргээж чадсангүй..24 эргэлтийн ялгаатай байдлын байрлалын спектрийн симуляци (Нэмэлт зураг 5a).Энэ нь поликатионууд байгаа үед αS-ийн С-терминал бүсийн ээрэх тохиргооны орон зайд давуу байрлалууд байгааг харуулж байна.Туршилтын EPR нөхцөлд (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, αS/pLK-ийн хувьд 84 ± 2%, 79 ± 7%, 47 ± 4%) конденсацийн үе дэх αS-ийн хэсгийг авч үзэхдээ Нэмэлт хэсгийг үзнэ үү. Өгөгдлийн шинжилгээний 2e-р зураг c), EPR аргаар илрүүлсэн тэлэлт нь конденсацийн үе дэх янз бүрийн поликатууд бүхий αS-ийн C-терминал бүсийн харилцан үйлчлэлийг голчлон тусгаж байгааг харж болно (TEMPOL-122- ашиглах үед гарсан гол өөрчлөлт). αS), уургийн конденсац биш.Сорьцонд бичил зуурамтгай чанар нэмэгдэж байгаа нь ажиглагдаж байна.Хүлээгдэж байсанчлан, LLPS-ээс бусад нөхцөлд уургийн EPR спектр нь холимогт 1 M NaCl нэмэхэд бүрэн сэргээгдсэн (Нэмэлт зураг 4b).Ерөнхийдөө CW-EPR-ээр илрүүлсэн өөрчлөлтүүд нь конденсацийн фазын янз бүрийн поликатуудтай αS-ийн C-терминал бүсийн харилцан үйлчлэлийг голчлон тусгаж байгааг харуулж байгаа бөгөөд энэ харилцан үйлчлэл нь Tau-тай харьцуулахад pLK-тэй илүү хүчтэй байдаг.
Коацерват дахь уургийн талаар илүү бүтцийн мэдээлэл авахын тулд бид уусмал дахь NMR ашиглан LLPS системийг судлахаар шийдсэн.Гэсэн хэдий ч бид зөвхөн тархсан үе шатанд үлдсэн αS фракцыг илрүүлж чадсан бөгөөд энэ нь коацерват доторх уургийн динамик багасч, NMR шинжилгээнд уусмалын доод хэсэгт нягт фаз үүссэнтэй холбоотой байж болох юм.Бид LLPS дээжийн тархсан үе шатанд үлдсэн уургийн бүтэц, динамикийг NMR (Нэмэлт зураг 5c, d) ашиглан шинжлэхэд уураг нь pLK болон ΔNt-Tau байгаа үед бараг ижилхэн ажиллаж байгааг бид анзаарсан. Эдгээр нь уургийн нурууны хоёрдогч бүтэц, динамик байдалд байсан нь хоёрдогч химийн шилжилт ба R1ρ сулрах туршилтаар илэрсэн.NMR-ийн өгөгдөл нь αS-ийн C-төгсгөл нь поликатионуудтай харилцан үйлчлэлийн улмаас бусад уургийн дарааллын нэгэн адил эмх замбараагүй байдлаа хадгалахын зэрэгцээ конформацийн уян хатан чанараа ихээхэн алддаг болохыг харуулж байна.
TEMPOL-122-αS өтгөрүүлсэн үе шатанд ажиглагдсан CW-EPR дохионы тэлэлт нь уургийн поликатионуудтай харилцан үйлчлэлцэж байгааг илтгэдэг тул бид LLPS байхгүй үед αS-ийн янз бүрийн поликатионуудтай холбогдох хамаарлыг үнэлэхийн тулд EPR титрлэлтийг хийсэн. Buffer LLPS), шингэрүүлсэн болон төвлөрсөн фазуудад харилцан үйлчлэл нь ижил байна гэсэн санааг харуулж байна (энэ нь бидний өгөгдөл, Нэмэлт зураг 4а ба Нэмэлт зураг 6-р батлагдсан).Гол зорилго нь бүх коацерватууд нь нийтлэг шингэн шинж чанартай хэдий ч молекулын түвшинд ямар нэгэн үндсэн ялгавартай зан чанарыг харуулдаг эсэхийг шалгах явдал байв.Хүлээгдэж буйгаар EPR спектр нь поликатийн концентраци нэмэгдэхийн хэрээр өргөжиж, бүх харилцан үйлчлэлийн түншүүдийн молекулын харилцан үйлчлэлийн улмаас молекулын уян хатан чанар бараг ханасан хүртэл буурч байгааг харуулж байна (Зураг 3e, Нэмэлт зураг 6).pLK нь ΔNt-Tau болон Tau441-тэй харьцуулахад бага молийн харьцаатай (поликаци:αS) энэ ханалтыг олж авсан.Үнэн хэрэгтээ n ижил ба бие даасан холболтын талбайг тооцсон ойролцоо загвартай өгөгдлийг харьцуулах нь pLK (~5 μM)-ийн илэрхий диссоциацийн тогтмол нь Tau441 эсвэл ΔNt-Tau (~50 μM) -ээс бага хэмжээний дараалал болохыг харуулсан. ).µM).Хэдийгээр энэ нь ойролцоогоор тооцоолол боловч αS нь тасралтгүй эерэг цэнэгийн бүсүүдтэй энгийн поликатуудад илүү их хамааралтай болохыг харуулж байна.αS ба янз бүрийн поликатуудын хоорондын хамаарлын ялгааг харгалзан бид тэдгээрийн шингэний шинж чанар нь цаг хугацааны явцад өөр өөр өөрчлөгдөж, улмаар өөр өөр LSPT процесст өртөж болзошгүй гэж бид таамагласан.
Уургийн коацерват дотор маш их ачаалалтай орчин, уургийн амилоид шинж чанарыг харгалзан бид LSPT-ийн боломжит процессуудыг илрүүлэхийн тулд коацерватын зан төлөвийг цаг хугацааны явцад ажигласан.BF болон CF микроскоп ашиглан (Зураг 4) бид αS/Tau441 нь уусмалд их хэмжээгээр коацерват болж, том дуслууд үүсгэж, худгийн ёроолд бүрэн дусал хэлбэрээр чийгшдэгийг ажиглав (Нэмэлт зураг 1). 7г);Эдгээр ёроолд үүссэн бүтцийг бид "уургийн сал" гэж нэрлэдэг.Эдгээр бүтэц нь хайлуулах чадвараа хадгалсан тул шингэн хэвээр байсан (Нэмэлт Зураг 7б) ба LLPS идэвхжсэнээс хойш хэдэн цагийн турш харагдах боломжтой байв (Зураг 4 ба Нэмэлт зураг 7c).Тэнцвэргүй цэнэгтэй, улмаар электростатик гадаргуугийн өндөр потенциалтай электростатик коацерватуудын хувьд чийгшүүлэх процесс нь гидрофобик материалаас илүү гидрофилик материал (Нэмэлт зураг 7а) дээр таатай байгааг бид ажигласан.αS/ΔNt-Tau-ийн нэгдэл, рафтинг мэдэгдэхүйц багассан бол αS/pLK конденсат мэдэгдэхүйц багассан (Зураг 4).Богино инкубацийн хугацаанд αS/pLK дуслууд нэгдэж, гидрофилик гадаргууг норгох боломжтой байсан ч энэ процесс хурдан зогсч, 5 цагийн инкубацийн дараа зөвхөн хязгаарлагдмал нэгдэх үйл явц, чийгшүүлэх нь ажиглагдаагүй.– гель-дуслын шилжилт.
LLPS буфер дэх 100 мкМ αS (1% флюресцент шошго) агуулсан коацерват дээжийн BF (саарал өнгийн хавтан) ба CF (баруун талын самбар, AF488 шошготой αS ногоон) 100 мкМ Tau441 (дээд) флюресценцийн зураг)ΔNt -Тау (төв) эсвэл 1 мМ pLK (доод) өөр өөр инкубацийн хугацаа ба фокусын өндөрт (z, хавтангийн худгийн ёроолоос зай).Туршилтыг бие биенээсээ үл хамааран 4-6 удаа давтан хийж, ижил үр дүнд хүрсэн.αS/Tau441 коацерватыг 24 цагийн дараа норгож, зураг дээрхээс том сал үүсгэдэг.Бүх зургийн масштабын талбар нь 20 микрон байна.
Дараа нь бид αS/Tau441 LLPS-д үүссэн шингэнтэй төстэй уургийн том сангууд нь судлагдсан уургийн аль нэгийг амилоид нэгтгэхэд хүргэх эсэхийг асуув.Бид дээрхтэй ижил нөхцөлд αS/Tau441 дуслын боловсорч гүйцсэнийг WF микроскопоор ажигласан боловч 1 μM AF488 шошготой αS ба Atto647N шошготой Tau441 (Зураг 5a) ашигласан.Хүлээгдэж буйгаар бид боловсорч гүйцсэн бүх хугацаанд уургийн бүрэн нутагшлыг ажигласан.Сонирхолтой нь, ойролцоогоор.5 цагийн дараа салнуудын дотор илүү эрчимтэй дугуй бус бүтэц ажиглагдсан бөгөөд бид үүнийг "цэгүүд" гэж нэрлэсэн бөгөөд тэдгээрийн зарим нь αS-ээр нэгдмэл байдлаар, зарим нь Tau441-ээр баяжуулсан (Зураг 5а, цагаан сум).Эдгээр толбо нь αS/ΔNt-Tau-тай харьцуулахад αS/ΔNt-Tau-д илүү их хэмжээгээр сал дотор ажиглагддаг.pLK болон Tau системийн дуслуудад хайлуулах/чийгшүүлэх чадваргүй тодорхой толбо байгаагүй.αS болон Tau441 агуулсан эдгээр толбо нь амилоид төст агрегат мөн эсэхийг шалгахын тулд бид CF микроскоп ашиглан ижил төстэй туршилтыг хийж, Tau441-ийг Atto647N гэж тэмдэглэж, эхнээс нь 12.5 μM амилоид өвөрмөц тиофлавин-Т (ThT) нэмсэн.будах.Хэдийгээр αS/Tau441 дусал эсвэл салны ThT-ийн будалт 24 цагийн инкубацийн дараа ч ажиглагдаагүй (Зураг 5b, дээд эгнээ - уургийн сал дээр үлдсэн дуслууд) Сал доторх Atto647N-Tau441 агуулсан ThT эерэг бүтэц маш сул байв.Энэ нь өмнө нь тайлбарласан толбоны хэмжээ, хэлбэр, байршлыг давтаж (Зураг 5b, дунд ба доод эгнээ) толбо нь хөгшрөлтийн шингэний коацерватад үүссэн амилоид төст агрегатуудтай тохирч болохыг харуулж байна.
WF 25 μM αS нь янз бүрийн инкубацийн хугацаа болон фокусын өндөрт (z, хязгаарлагдмал ёроолоос зай) LLPS буфер бүхий микроскопын хавтангийн нүхэнд 25 μM Tau441 (1 μM AF488 шошготой αS ба Atto647N шошготой Tau441) байгаа үед) .Зургаан туршилтыг бие даан давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N шошготой Tau441) болон 12.5 μM тиофлавин-Т (ThT) байгаа үед 25 μM αS-ийн CF микроскопийн зураг.Дээд ба дунд эгнээнд жинлэсэн уургийн дусал болон хуримтлагдсан уургийн сал, толбыг тус тус үзүүлэв.Доод эгнээнд 3 бие даасан хуулбараас сал, дуслын зургийг харуулав.Цагаан сум нь хоёр самбар дээрх ThT эерэг цэгүүдийг заана.Бүх зургийн масштабын талбар нь 20 микрон байна.
Шингэнээс хатуу руу шилжих үед коацерват уургийн сүлжээнд гарсан өөрчлөлтийг нарийвчлан судлахын тулд бид флюресценцийн насан туршийн дүрслэл (FLIM) болон Форстер резонансын энерги дамжуулах микроскопийг (FRET) ашигласан (Зураг 6 ба нэмэлт зураг 8, 9).Давхаргын коасерват боловсорч гүйцсэн нь илүү нягтаршсан эсвэл бүр хатуу бүтэцтэй уургийн бүтэцтэй болох нь уураг болон түүнд бэхлэгдсэн флюресцент датчикийн хооронд илүү нягт холбоо тогтооход хүргэдэг бөгөөд энэ нь датчикийн ашиглалтын хугацааг богиносгоход (τ) илэрдэг бөхөөх нөлөөг үүсгэж болзошгүй гэж бид таамагласан. Өмнө дурьдсанчлан40.,41 ,42.Нэмж дурдахад, давхар шошготой дээжийн хувьд (AF488 ба Atto647N нь FRET донор ба хүлээн авагч будагч бодисууд) τ-ийн энэхүү бууралт нь коацерват конденсац болон LSPT-ийн үед FRET(E) үр ашгийн өсөлттэй хамт байж болно.Бид LLPS αS/Tau441 ба αS/ΔNt-Tau дээжинд цаг хугацааны явцад сал болон толбо үүсэхэд хяналт тавьсан (LLPS буфер дэх уураг тус бүрийн 25 μМ αS ба/эсвэл Tau441 эсвэл ΔNt-Tau гэсэн шошготой αS ба/эсвэл Atto647N шошготой AF488 агуулсан 1 μМ).AF488 (τ488) ба Atto647N (τ647N) датчикуудын флюресценцийн ашиглалтын хугацаа коацерватууд боловсорч гүйцсэн үед бага зэрэг буурсан ерөнхий хандлагыг бид ажигласан (Зураг 6 ба Нэмэлт зураг 8c).Сонирхолтой нь, энэ өөрчлөлт нь сал доторх цэгүүдийн хувьд мэдэгдэхүйц сайжирсан (Зураг 6c) нь цэгүүдэд уургийн конденсаци үүссэнийг харуулж байна.Үүнийг батлахын тулд αS/ΔNt-Tau дусалд 24 цагийн турш флюресценцийн амьдрах хугацаанд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт ажиглагдаагүй (Нэмэлт зураг 8d) нь дуслын гель үүсэх нь толбо үүсэхээс ялгаатай процесс бөгөөд энэ нь молекулын томоохон өөрчлөн байгуулалт дагалддаггүй болохыг харуулж байна. коацерват дотор.Цэгүүд нь αS, ялангуяа αS/Tau441 системийн хувьд өөр өөр хэмжээтэй, хувьсах агуулгатай байдаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй (Нэмэлт Зураг 8e).Спот флюресценцийн ашиглалтын хугацаа буурсан нь ялангуяа Tau441 шошготой Atto647N (Нэмэлт зураг 8a)-ийн эрчим нэмэгдэж, αS/Tau441 болон αS/ΔNt-Tau системүүдийн аль алиных нь FRET-ийн үр ашиг өндөр болсон нь LLPS-д таван цагийн дараа конденсац үүсэхийг харуулж байна. өдөөсний дараа статик цахилгаан доторх уургууд нь өтгөрдөг.αS/ΔNt-Tau-тай харьцуулахад бид αS/Tau441 цэгүүдэд τ647N бага, бага зэрэг өндөр τ488 утгыг ажиглаж, бага, илүү жигд бус FRET утгууд дагалдлаа.Энэ нь αS/Tau441 системд αS/Tau441 системд ажиглагдсан болон хүлээгдэж буй αS-ийн элбэг дэлбэг байдал нь Tau-тай харьцуулахад илүү гетероген, ихэвчлэн дэд стоихиометр байдагтай холбоотой байж болох юм, учир нь Tau441 нь өөрөө мөн LLPS болон нэгтгэх чадвартай байдаг (Нэмэлт Зураг 8e) .Гэсэн хэдий ч Tau441 болон αS хоёулаа байгаа үед дуслын нэгдэл, сал үүсэх, хамгийн чухал нь шингэн шиг коацерват доторх уургийн агрегацын зэрэг хамгийн их байдаг.
αS/Tau441 ба αS/ΔNt-Tau-ийн насан туршийн флюресцент микроскопийн (FLIM) зураг, уураг тус бүрийн 25 μМ (1 мкм AF488 шошготой αS ба 1 мкМ Atto647N шошготой Tau441 эсвэл ΔNt-Tauffer) дээр.Баганууд нь янз бүрийн боловсорч гүйцэх хугацаанд (30 мин, 5 цаг, 24 цаг) LLPS дээжийн төлөөллийн зургийг харуулж байна.Улаан хүрээ нь αS/Tau441 толбо агуулсан бүсийг харуулж байна.Амьдралын хугацааг өнгөт баар хэлбэрээр харуулав.Бүх зургийн хувьд масштабын талбар = 20 мкм.b Сонгосон хэсгийн томруулсан FLIM дүрсийг a самбарын улаан хайрцагт харуулав.Амьдралын хүрээг a самбар дээрх ижил өнгийн хуваарийг ашиглан харуулав.Хуваарийн мөр = 5 мкм.c Tau441 болон αS-д бүртгэгдсэн FLIM зурагт тодорхойлогдсон өөр төрлийн уургийн (дусал-D-, сал-R- ба толбо-P) AF488 (αS-д хавсаргасан) эсвэл Atto647N (Тау-д хавсаргасан)-ыг харуулсан гистограммууд болон αS/ΔNt-Tau коацерват дээжүүд (D нь N = 17-32 ROI, R хувьд 29-44 ROI, онооны хувьд 21-51 ROI).Дундаж ба дундаж утгыг шар дөрвөлжин, хар зураасаар тус тус үзүүлэв.Хайрцагны доод ба дээд хязгаар нь эхний болон гурав дахь квартилуудыг тус тус илэрхийлдэг бөгөөд 1.5 дахин их квартил хоорондын хязгаар (IQR) доторх хамгийн бага ба хамгийн их утгыг сахал хэлбэрээр харуулав.Хэт ихийг хар очир алмаазаар харуулсан.Хос тархалтын хоорондын статистик ач холбогдлыг тэгш бус хэлбэлзэлтэй гэж үзэн хоёр түүвэрт t-тест ашиглан тодорхойлсон.Хоёр сүүлт t-тестийн p-утгыг харьцуулсан өгөгдөл бүрийн хувьд одоор харуулсан (* p-утга > 0.01, ** p-утга > 0.001, *** p-утга > 0.0001, **** p-утга > 0.00001), ns Үл тоомсорлохыг заана (p-утга > 0.05).Яг p утгыг 1-р хүснэгтэд өгсөн бөгөөд анхны өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр үзүүлэв.
Толбо/агрегатуудын амилоид төст шинж чанарыг цаашид харуулахын тулд бид будаагүй коацерват дээжийг 24 цагийн турш (1 М) NaCl-ийн өндөр концентрацитай боловсруулсны үр дүнд дүүргэгчийг уургийн коацерватаас салгасан.Атомын хүчний микроскоп (AFM) ашиглан тусгаарлагдсан дүүргэгчийг (өөрөөр хэлбэл дүүргэгчийн сарнисан уусмал) ажиглахад бид 15 нм орчим тогтмол өндөртэй голдуу бөмбөрцөг хэлбэрийн морфологийг ажигласан бөгөөд энэ нь давсны өндөр агууламжтай нөхцөлд нэгдэх хандлагатай байдаг. гадаргуу дээрх хүчтэй гидрофобик нөлөөгөөр ердийн амилоид фибрилүүдийн зан байдал (фибрил нь ихэвчлэн ~10 нм өндөртэй байдаг гэдгийг анхаарна уу) (Нэмэлт зураг 10a).Сонирхолтой нь, тусгаарлагдсан дүүргэгчийг ThT-ийн стандарт флюресценцийн шинжилгээнд инкубацийн үед бид ThT флуоресценцийн квант гарцын огцом өсөлтийг ажигласан нь будгийг ердийн αS амилоид фибрилээр өсгөвөрлөх үед ажиглагдсантай харьцуулахад ажиглагдсан (нэмэлт зураг 10b) гэж үзэж байна. коацерват агрегатууд нь амилоид төст бүтэцтэй..Үнэн хэрэгтээ дүүргэгч нь давсны өндөр концентрацийг тэсвэрлэдэг боловч ердийн амилоид фибрил шиг 4 М гуанидин хлорид (GdnHCl) -д мэдрэмтгий байсан (Нэмэлт зураг 10c).
Дараа нь бид нэг молекулын флюресцент, тусгай флюресценцийн хамаарал/хөндлөн хамаарал спектроскопи (FCS/FCCS), хоёр өнгөт давхцлыг илрүүлэх тэсрэлт шинжилгээ (TCCD) ашиглан дүүргэгчийн найрлагад дүн шинжилгээ хийсэн.Үүний тулд бид αS ба Tau441 (хоёулаа 25 μM) агуулсан 100 мкл LLPS дээжинд 24 цагийн инкубацийн дараа үүссэн дүүргэгчийг 1 μM AF488 шошготой αS ба 1 μM Atto647N шошготой Tau441-ийн хамт тусгаарласан.Үүссэн тархсан дүүргэгчийн уусмалыг ижил PEG-гүй буфер ба 1 M NaCl (ижил буфер) ашиглан мономолекул төлөвт шингэлнэ, LLPS болон уургийн хооронд үүсч болзошгүй электростатик харилцан үйлчлэлээс сэргийлнэ.Нэг молекулын цагийн траекторийн жишээг Зураг 7а-аас харж болно.FCCS/FCS шинжилгээ (хөндлөн хамаарал, CC ба автокорреляци, АС) нь дээжинд αS ба tau агуулсан агрегатууд элбэг байгааг харуулсан (Зураг 7b, зүүн талын самбар дээрх CC муруйг харна уу) ба үлдэгдэл мономер уургийн илүүдэл үүссэн. шингэлэх процессын үр дүн (Зураг 7b, зүүн талын самбар дээрх АС муруйг үзнэ үү).Зөвхөн мономер уураг агуулсан дээжийг ашиглан уусмалын ижил нөхцөлд гүйцэтгэсэн хяналтын туршилтууд нь CC муруй байхгүй бөгөөд хувьсах гүйдлийн муруй нь мономер уургууд нь хүлээгдэж буй тархалтын коэффициенттэй (Зураг 7б) нэг бүрэлдэхүүн хэсгийн тархалтын загвартай (том. 4) сайн тохирдог. ), баруун самбар).Нэгтгэсэн хэсгүүдийн тархалтын коэффициент нь 1 мкм2/с-ээс бага, мономер уургийнх нь ойролцоогоор 1 мкм2/с байна.50-100 мкм/с;Эдгээр утгууд нь ижил төстэй уусмалын нөхцөлд αS амилоид фибрил болон мономер αS-ийн өмнө хэвлэгдсэн утгатай ижил байна44.Бид дүүргэгчийг TCCD тэсрэлтийн шинжилгээгээр шинжлэхэд (Зураг 7c, дээд самбар) тусгаарлагдсан дүүргэгч бүрт (αS/Tau гетероагрегат) илрүүлсэн дүүргэгчийн 60 орчим хувь нь αS ба tau хоёуланг нь, 30 орчим хувь нь зөвхөн агуулагддаг болохыг олж мэдсэн. tau, зөвхөн 10% орчим αS.αS/Tau гетероагрегатуудын стехиометрийн шинжилгээ нь ихэнх гетероагрегатууд нь tau-аар баяжуулагдсан болохыг харуулсан (стоихиометрийн хэмжээ 0.5-аас доош, нэг агрегатад ногдох tau молекулын дундаж тоо αS молекулаас 4 дахин их) бөгөөд энэ нь FLIM in situ-д ажиглагдсан бидний ажилтай нийцэж байна. туршилтууд..FRET шинжилгээгээр эдгээр агрегатууд нь хоёулаа уураг агуулдаг болохыг харуулсан боловч энэ тохиолдолд FRET-ийн бодит утга нь тийм ч чухал биш юм, учир нь туршилтанд ашигласан шошгогүй уургийн илүүдэлээс болж агрегат тус бүрт флюрофорын тархалт санамсаргүй байдлаар явагдсан.Сонирхолтой нь, бид 45,46 боловсорч гүйцсэн амилоид агрегацын дутагдалтай Тау хувилбарыг ашиглан ижил дүн шинжилгээ хийх үед (Нэмэлт 11a, b-г үзнэ үү) хэдийгээр αS электростатик агрегатууд ижил байсан ч (Нэмэлт Зураг 11c, d) байгааг анзаарсан. коацерват дотор дүүргэгч үүсгэх чадвар эрс буурч, FLIM нь in situ туршилтаар хэд хэдэн толбыг илрүүлж, тусгаарлагдсан дүүргэгчийн дээжийн хувьд сул хөндлөн корреляцийн муруй ажиглагдсан.Гэсэн хэдий ч цөөн тооны илрүүлсэн дүүргэгчийн хувьд (Тау441-ийн зөвхөн аравны нэг) дүүргэгч бүр нь энэ Тау хувилбараас αS-ээр баяжуулсан, илрүүлсэн дүүргэгчийн ойролцоогоор 50% нь зөвхөн αS молекул агуулсан, αS нь нэг төрлийн бус илүүдэлтэй байгааг бид ажигласан. .агрегатууд (Нэмэлт 11e зургийг үз), Tau441-ийн үүсгэсэн нэг төрлийн бус дүүргэгчээс ялгаатай (Зураг 6f).Эдгээр туршилтуудын үр дүн нь хэдийгээр αS өөрөө коацерват дотор tau-тай хамт хуримтлагдах чадвартай боловч эдгээр нөхцөлд tau бөөмжилт илүү таатай байдаг ба үүссэн амилоид төст агрегатууд нь αS ба tau хэлбэрийн үүрэг гүйцэтгэх чадвартай болохыг харуулсан.Гэсэн хэдий ч, tau-аар баялаг цөм үүссэний дараа αS ба tau-ийн хоорондох гетеротип харилцан үйлчлэл нь tau молекулуудын хоорондын гомотип харилцан үйлчлэлээс илүүтэйгээр нэгтгэгддэг;Бид мөн шингэн αS/tau коацерват дахь уургийн сүлжээг ажигладаг.
a αS/Tau441 электростатик коацерватад үүссэн тусгаарлагдсан агрегатуудын нэг молекулын флюресценцийн түр зуурын ул мөр.αS/Tau441 коагрегатуудад тохирох тэсрэлт (заасан босго хэмжээнээс дээш) илрүүлэх гурван сувагт (AF488 ба Atto647N шууд өдөөлтийн дараах ялгаралт, хөх, улаан шугам, шууд бус өдөөлтийн дараах Atto647N ялгаралт), FRET, ягаан шугам) ажиглагдсан.b LLPS-ээс авсан тусгаарлагдсан αS/Tau441 дүүргэгчийн дээжийн FCS/FCCS шинжилгээ (зүүн самбар).AF488 ба Atto647N-ийн автокорреляцийн (AC) муруйг цэнхэр, улаан өнгөөр ​​тус тус үзүүлсэн бөгөөд хоёр будгийг агуулсан дүүргэгчтэй холбоотой хөндлөн хамаарлын (CC) муруйг нил ягаан өнгөөр ​​үзүүлэв.Хувьсах гүйдлийн муруй нь шошготой мономер болон нэгтгэсэн уургийн төрлүүд байгааг харуулдаг бол CC муруй нь зөвхөн давхар шошготой агрегатуудын тархалтыг харуулдаг.Ижил шинжилгээ, гэхдээ тусгаарлагдсан цэгүүдтэй ижил уусмалын нөхцөлд зөвхөн мономер αS болон Tau441 агуулсан дээжийг баруун талын самбарт хяналт болгон харуулав.c αS/Tau441 электростатик коацерватт үүссэн тусгаарлагдсан дүүргэгчийн нэг молекулын флюресценцийн флэш шинжилгээ.Дөрвөн өөр давталтаар олдсон дүүргэгч бүрийн мэдээллийг (N = 152) тэдгээрийн стехиометр, S утгууд болон FRET үр ашгийн эсрэг (дээд самбар, өнгөний талбар нь тохиолдлыг илэрхийлдэг) харьцуулсан болно.Гурван төрлийн дүүргэгчийг ялгаж болно: -αS-зөвхөн S~1 ба FRET~0 дүүргэгч, зөвхөн S~0 ба FRET~1 бүхий Tau дүүргэгч, завсрын S ба FRET бүхий нэг төрлийн бус Tau/αS агрегатууд Хэмжээний тооцоолол. Нэг төрлийн бус дүүргэгч бүрээс (N = 100) илрүүлсэн маркер уургийн аль алиных нь хэмжээг доод самбарт харуулав (өнгөт хуваарь нь тохиолдсон байдлыг илэрхийлдэг).Түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
Шингэн уургийн конденсатын боловсорч гүйцсэн буюу хөгшрөлтийн хугацаа өнгөрөх тусам гель хэлбэртэй эсвэл хатуу бүтэцтэй болох нь конденсат47 физиологийн хэд хэдэн үйл ажиллагаанаас гадна өвчинд оролцдог бөгөөд энэ нь амилоид бөөгнөрөл үүсэхээс өмнөх хэвийн бус үйл явц юм 7, 48, 49. Энд Бид үе шат тусгаарлалт, зан төлөвийг нарийвчлан судалдаг.Бага микромолийн концентраци болон физиологийн хамааралтай нөхцөлд хяналттай орчинд санамсаргүй поликатууд байгаа LSPT αS (αS-ийн тооцоолсон физиологийн концентраци >1 μM50 гэдгийг анхаарна уу), LPS-ийн термодинамикаар удирдуулсан ердийн зан үйлийн дагуу.Физиологийн рН-ийн өндөр сөрөг цэнэгтэй С-терминал бүсийг агуулсан αS нь электростатик үйл явцаар pLK эсвэл Tau зэрэг өндөр катионик эмх замбараагүй пептидүүдийн дэргэд LLPS-ээр дамжуулан усан уусмалд уургаар баялаг дусал үүсгэх чадвартай болохыг бид олж мэдсэн. агрегацын макромолекулуудын дэргэд нарийн төвөгтэй конденсац.Энэ процесс нь αS нь in vitro болон in vivo аль алинд нь өвчинтэй холбоотой бөөгнөрөлтэй холбоотой янз бүрийн поликатион молекулуудтай тулгардаг эсийн орчинд хамааралтай нөлөө үзүүлж болно51,52,53,54.
Олон тооны судалгаагаар дусал дахь уургийн динамик нь боловсорч гүйцэх үйл явцыг тодорхойлдог гол хүчин зүйлүүдийн нэг гэж үздэг55,56.Поликатионуудтай электростатик αS коацерватуудад боловсорч гүйцэх процесс нь поликатионуудтай харилцан үйлчлэлийн хүч, валент, эдгээр харилцан үйлчлэлийн олон байдлаас хамаардаг.Тэнцвэрийн онол нь хоёр шингэн төлөвийн тэнцвэрт байдал нь LLPS-ийг хөдөлгөдөг биополимерээр баялаг том дусал байх болно гэж үздэг57,58.Дуслын өсөлтийг Оствальд боловсорч 59, нэгдэх60 эсвэл тархсан фаз дахь чөлөөт мономерыг хэрэглэснээр хүрч болно61.αS ба Tau441, ΔNt-Tau эсвэл pLK-ийн хувьд энэ судалгаанд ашигласан нөхцөлд уургийн ихэнх хэсэг нь конденсатад төвлөрч байсан.Гэсэн хэдий ч бүрэн хэмжээний tau дуслууд гадаргууг чийгшүүлэх үед хурдан нийлдэг ч ΔNt-Tau болон pLK-д дусал нэгдэх, чийглэх нь хэцүү байсан нь эдгээр хоёр систем дэх шингэний шинж чанар хурдан алдагдахыг харуулж байна.Бидний FLIM-FRET шинжилгээний дагуу хөгшрөлтийн pLK болон ΔNt-Tau дуслууд нь анхны дуслуудтай ижил төстэй уургийн агрегацын түвшинг (ижил төстэй флюресценцийн ашиглалтын хугацаа) харуулсан нь анхны уургийн сүлжээг илүү хатуу байсан ч хадгалсан болохыг харуулж байна.
Бид туршилтын үр дүнг дараах загварт оновчтой болгож байна (Зураг 8).Анх түр зуур үүссэн дуслууд нь ихэвчлэн цахилгаан статик нөхөн олговоргүй уургийн сүлжээнүүд байдаг тул цэнэгийн тэнцвэргүй байдал, ялангуяа дуслын интерфэйсийн хэсгүүд байдаг бөгөөд үүний үр дүнд өндөр цахилгаан статик гадаргуутай дуслууд үүсдэг.Цэнэглэлийг нөхөх (ихэвчлэн валентын хомсдол гэж нэрлэдэг үзэгдэл) ба дуслуудын гадаргуугийн потенциалыг багасгахын тулд дуслууд нь шингэрүүлсэн фазын шинэ полипептидүүдийг оруулж, цэнэгийн харилцан үйлчлэлийг оновчтой болгохын тулд уургийн сүлжээг дахин зохион байгуулж, бусад дуслуудтай харьцаж болно.гадаргуутай (чийгшүүлэх).αS/pLK дуслууд нь энгийн уургийн сүлжээ (зөвхөн αS ба pLK хоорондын гетеротип харилцан үйлчлэл) ба уураг-уургийн харилцан үйлчлэлд илүү ойр байдаг тул конденсатын цэнэгийг илүү хурдан тэнцвэржүүлж чаддаг;Үнэндээ бид анх үүссэн αS/pLK коацерватуудад αS/Tau-тай харьцуулахад илүү хурдан уургийн кинетикийг ажигласан.Валент хомсдсоны дараа харилцан үйлчлэл нь түр зуурын шинж чанараа алдаж, дуслууд нь шингэний шинж чанараа алдаж, гель хэлбэртэй, галд өртөхгүй, электростатик гадаргуугийн потенциал багатай (тиймээс гадаргууг чийглэх боломжгүй) дусал болж хувирдаг.Үүний эсрэгээр, αS/Tau дусал нь илүү нарийн төвөгтэй уургийн сүлжээ (гомотип ба гетеротип харилцан үйлчлэлтэй) ба уургийн харилцан үйлчлэлийн сул шинж чанараас шалтгаалан дуслын цэнэгийн тэнцвэрийг оновчтой болгоход үр ашиг багатай байдаг.Үүний үр дүнд дуслууд нь шингэний шинж чанарыг удаан хугацаанд хадгалж, гадаргуугийн өндөр электростатик потенциалыг харуулдаг бөгөөд тэдгээрийг нэгтгэх, өсгөх (ингэснээр дуслуудын гадаргуугийн талбай/эзэлхүүний харьцааг багасгах) ба гидрофиль гадаргуугийн химийн бодисыг чийгшүүлэх замаар багасгах хандлагатай байдаг.Энэ нь уургийн сүлжээн дэх цэнэгийг оновчтой болгохын тулд байнгын эрэл хайгуулын улмаас харилцан үйлчлэл нь маш түр зуурын шинж чанартай байдаг тул шингэний шинж чанарыг хадгалдаг томоохон төвлөрсөн уургийн сангуудыг бий болгодог.Сонирхолтой нь, байгалийн гаралтай зарим изоформууд62 зэрэг Таугийн N төгсгөлийн тайралт хэлбэрүүд нь завсрын шинж чанартай байдаг ба зарим коацерватууд αS-тэй хөгширч, удаан эдэлгээтэй гель хэлбэртэй дусал болж хувирдаг бол зарим нь том шингэн конденсат болж хувирдаг.αS электростатик коацерватуудын боловсорч гүйцсэн энэхүү хоёрдмол байдал нь конденсат дахь валентийн хомсдол ба электростатик шигших хоорондын хамаарлыг конденсатын хэмжээ болон шингэний шинж чанарыг хянах түлхүүр гэж тодорхойлсон сүүлийн үеийн LLPS онолын болон туршилтын судалгаатай нийцэж байна.Механизм 58.61.
Энэ схем нь LLPS болон LSPT-ээр дамжуулан αS ба Tau441-ийн амилоид нэгтгэх замыг харуулж байна.Нэмэлт анионоор баялаг (улаан) ба катионоор баялаг (цэнхэр) бүсүүдтэй, хангалттай валенттай αS ба tau электростатик коацерватууд нь гадаргуугийн энерги багатай тул нэгдэл багатай тул дусал хурдан хөгшрөхөд хүргэдэг.Тогтвортой бөөгнөрөлгүй гель төлөвт хүрнэ..Энэ нөхцөл байдал нь αS/pLK системийн хувьд маш таатай, учир нь түүний өндөр ойр дотно байдал, уураг хосын харилцан үйлчлэлийн сүлжээ нь илүү хялбар бөгөөд энэ нь гель шиг хурдан шилжих боломжийг олгодог.Эсрэгээр, валент нь хангалтгүй дуслууд, улмаар харилцан үйлчлэлцэх боломжтой уургаар цэнэглэгдсэн хэсгүүд нь коацерватыг хайлуулж, гадаргуугийн өндөр энергийг багасгахын тулд гидрофил гадаргууг чийгшүүлэхэд хялбар болгодог.Сул Тау-Тау ба αS-Тау харилцан үйлчлэлээс бүрдсэн олон валент бүхий цогц сүлжээтэй αS/Tau441 коацерватуудын хувьд энэ нөхцөл байдал илүү тохиромжтой.Хариуд нь том коацерватууд нь шингэнтэй төстэй шинж чанараа хадгалж, уураг-уургийн бусад харилцан үйлчлэлийг бий болгоно.Эцсийн эцэст коацерват шингэний дотор αS ба tau хоёуланг нь агуулсан амилоид гетероген агрегатууд үүсдэг бөгөөд энэ нь мэдрэлийн эсийн доройтлын шинж тэмдэг болох агуулагдах биед агуулагдах бодисуудтай холбоотой байж болно.
αS/Tau441-ийн боловсорч гүйцсэн үед үүссэн их хэмжээний шингэнтэй төстэй бүтэц нь маш их ачаалалтай боловч динамик уургийн орчин ба бага хэмжээгээр αS/ΔNt-Tau коацерватууд нь уургийн бөөмжилтийг бий болгоход тохиромжтой нөөц юм.Энэ төрлийн уургийн коацерватуудад ихэвчлэн αS ба tau агуулсан хатуу уургийн агрегатууд үүсч байгааг бид үнэхээр ажигласан.Эдгээр гетероагрегатууд нь электростатик бус харилцан үйлчлэлээр тогтворждог, амилоид өвөрмөц ThT будгийг ердийн амилоид фибрилүүдийн нэгэн адил холбож чаддаг, мөн янз бүрийн нөлөөлөлд ижил төстэй эсэргүүцэлтэй байдаг гэдгийг бид харуулсан.LLPS-ээс үүссэн αS/tau агрегатууд нь амилоидтой төстэй шинж чанартай болохыг харуулсан.Үнэн хэрэгтээ, амилоид агрегацын дутагдалтай Tau-ийн боловсорч гүйцсэн хувилбар нь шингэний электростатик коацерват дотор эдгээр гетероген αS агрегатууд үүсэхэд ихээхэн доройтдог.αS/Tau441 дүүргэгч үүсэх нь зөвхөн коацерватуудын дотор ажиглагдсан бөгөөд энэ нь шингэн төст шинж чанарыг хадгалж үлдсэн бөгөөд хэрэв коацерват/дусал гель төлөвт хүрэхгүй бол хэзээ ч ажиглагддаггүй.Сүүлчийн тохиолдолд цахилгаан статик харилцан үйлчлэлийн хүч нэмэгдэж, үүний үр дүнд уургийн сүлжээний хатуу байдал нь амилоид бөөм үүсэхэд шаардлагатай уургийн шинэ харилцан үйлчлэлийг бий болгохын тулд уургийн шаардлагатай бүтцийн өөрчлөлтөөс сэргийлдэг.Гэсэн хэдий ч, энэ нь илүү уян хатан, шингэн төстэй коацерватуудад хүрч болох бөгөөд тэдгээр нь хэмжээ нь нэмэгдэх тусам шингэн хэвээр үлдэх магадлал өндөр байдаг.
Хурдан гельдэг жижиг дуслуудаас илүү том αS/Tau конденсатуудад конденсацын үе шатанд дүүргэгч үүсэх нь илүү тохиромжтой байдаг нь дуслын нэгдлийг хянах хүчин зүйлсийг тодорхойлох нь чухал ач холбогдолтой болохыг харуулж байна.Тиймээс зөвхөн фазыг салгах хандлагатай төдийгүй конденсатын хэмжээг зөв ажиллуулах, түүнчлэн өвчнөөс урьдчилан сэргийлэхийн тулд хянах шаардлагатай58,61.Бидний үр дүн нь αS/Tau системийн хувьд LLPS болон LSPT хоорондын тэнцвэрт байдлын ач холбогдлыг мөн онцолж байна.Бусад системд санал болгосны дагуу дусал үүсэх нь ханалтын нөхцөлд байгаа уургийн мономеруудын хэмжээг бууруулж амилоид бөөгнөрөлөөс хамгаалж болох боловч дуслын өндөр түвшинд дуслын нэгдэл нь удаан хэлбэрийн өөрчлөлтөөр уургийн дотоод бөөгнөрөлд хүргэдэг.уургийн сүлжээ..
Ерөнхийдөө бидний өгөгдөл нь LSPT-ийн контекст дэх дусал сүлжээн дэх нэгдмэл валент болон сэтгэл хангалуун/сэтгэл ханамжгүй харилцан үйлчлэлийн хамаарлыг хүчтэй онцолж байна.Тодруулбал, бид бүрэн хэмжээний αS/Tau441 конденсатууд нь үр ашигтай нэгдэж, цөм болж, уураг хоёуланг нь багтаасан амилоид төст гетероагрегат үүсгэдэг болохыг харуулж, бидний туршилтын үр дүнд үндэслэн молекулын механизмыг санал болгож байна.Бидний энд мэдээлсэн αS/Tau шингэний коацерват дахь хоёр уургийн нэгдэл нь өвчний шинж тэмдэг болох нэгдэл дэх хоёр уургийн хамт нутагшсантай холбоотой байж болох бөгөөд энэ нь LLPS болон LLPS-ийн хоорондын хамаарлыг ойлгоход хувь нэмэр оруулах болно. амилоид бөөгнөрөл нь мэдрэлийн доройтолд өндөр цэнэгтэй IDP-ийн замыг засдаг.
Мономер WT-αS, цистеины мутант (Q24C-αS, N122C-αS) ба ΔCt-αS хувилбарууд (Δ101-140) нь E. coli-д илэрхийлэгдэж, өмнө тайлбарласны дагуу цэвэршүүлсэн.Дисульфидын холбоо үүсэхээс сэргийлэхийн тулд αS цистеины мутантуудыг цэвэрлэх бүх үе шатанд 5 мМ DTT орсон.Tau441 изоформ (Addgene #16316-аас авсан плазмид), ΔNt-Tau хувилбар (Δ1–150, IVA-г CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC (G2316) болон Agg15-тай праймераар клончлох замаар олж авсан. 5 праймер) E. coli өсгөвөрүүд байсан OD600 = 0.6-0.7 хүртэл 37 ° C ба 180 rpm-д ургасан ба экспрессийг 37 ° C-д 3 цагийн турш IPTG-ээр үүсгэсэн.40С-т 15 минутын турш 11,500 xg эсийг хурааж, 150 мм NaCl агуулсан давсны уусмалаар угаана.Үрлэнг лизисын буферт дахин түдгэлзүүлнэ (1 л LB тутамд 20 мл: MES 20 мМ, рН 6.8, NaCl 500 мМ, EDTA 1 мМ, MgCl2 0.2 мм, DTT 5 мм, PMSF 1 мМ, бензамидин μМ10п).Хэт авианы алхмыг мөсөн дээр 80% -ийн далайцтай 10 импульс (1 минут асаалттай, 1 минут унтарсан) хийсэн.Нэг хэт авиан шинжилгээнд 60 мл-ээс хэтрэхгүй.E. coli lysates-ийг 95 ° C-т 20 минут халааж, дараа нь мөсөн дээр хөргөж, 40 минутын турш 127,000 × г-т центрифуг хийсэн.Тодруулсан дээд давхаргыг 3.5 кДа мембранд (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Их Британи) хэрэглэж, 4 л диализийн буфер (20 мМ MES, рН 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2, DTTm 2m)-ийн эсрэг диализ хийсэн. , PMSF 0.1 мМ) 10 цагийн турш.5 мл катион солилцооны баганыг (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, АНУ) тэнцвэржүүлэх буфер (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PMSF, 01) -аар тэнцвэржүүлсэн.Тау лизатыг 0.22 μм PVDF шүүлтүүрээр шүүж, 1 мл/мин урсгалын хурдтайгаар баганад тарьсан.Элюцийг аажмаар хийж, tau-г 15-30% элюцийн буфер (20 мМ MES, рН 6.8, 1 М NaCl, 1 мМ EDTA, 2 мМ MgCl2, 2 мм DTT, 0.1 мМ PMSF) -аар цэвэрлэв.Бутархайг SDS-PAGE-ээр шинжилж, хүлээгдэж буй молекул жинтэй нэг зурвас агуулсан аливаа фракцыг 10 кДа центрифугийн шүүлтүүр ашиглан баяжуулж, 10 мМ HEPES, рН 7.4, NaCl 500 мМ, DTT 2 мМ агуулсан буферээр сольсон. эцсийн уургийн концентраци 100 μM байна.Дараа нь уургийн уусмалыг 0.22 μм PVDF шүүлтүүрээр дамжуулж, хурдан хөлдөөж, -80 ° C-т хадгална.Protein K18-ийг профессор Альберто Боффи эелдэгээр хангасан.Бэлдмэлийн цэвэр байдал SDS-PAGE болон MALDI-TOF/TOF-ээр батлагдсан >95% байсан.Төрөл бүрийн цистеиныг AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) эсвэл TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канад) гэсэн химийн шошготой.шингээлт ба MALDI-TOF/TOF-аар батлагдсан.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau болон K18-ийг ижил журмын дагуу Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Герман) ашиглан 191 ба 322 байрлалд уугуул цистеины үлдэгдэл гэж тэмдэглэв.αS болон Tau441-ийн үлдэгдэлд ногдох цэвэр төлбөрийг CIDER66 ашиглан үүсгэсэн.
Хатуу поли-Л-лизин (PLK DP 90-110, ханган нийлүүлэгч болох Alamanda Polymers Inc, Хантсвилл, Алабама, АНУ-ын NMR-ийн дагуу) 10 мМ HEPES, 100 мм NaCl, рН 7.4-10 мм концентрацид уусгаж, процессыг 5 удаа дууны долгионоор хийсэн. минутыг хэт авианы усан ваннд хийж, -20 хэмд хадгална.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) болон FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) нь усанд уусдаг бөгөөд LLPS буферт өргөн тархсан байдаг.Диализ нь бохирдуулагч давсыг зайлуулдаг.Дараа нь тэдгээрийг 0.22 мкм нүхний хэмжээтэй тариурын шүүлтүүрээр шүүж, тэдгээрийн концентрацийг рефрактометр (Меттлер Толедо, Колумб, Охайо, АНУ) ашиглан тооцоолсон.LLPS дээжийг тасалгааны температурт дараах дарааллаар бэлтгэсэн: буфер ба экструзийг хольж, 1 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etan-) 1, 2-дийлдинитрил) тетра цууны хүчил (EDTA, карбоксинт) ба 1% протеазын дарангуйлагчийн холимог (PMSF 100 мМ, бензимид 1 мМ, лейпептин 5 мкМ).Дараа нь αS ба ууссан поликатионууд (pLK эсвэл Tau сонголтууд) нэмэгддэг.Тиофлавин-Т хугацааны цуврал туршилтуудын хувьд (ThT, Carbosynth, Compton, UK) нийт ThT концентрацийг αS концентрацийн тал хувь байхаар ашиглана.Дээжийг нэгэн төрлийн болгохын тулд зөөлөн боловч сайтар холино.Бүрэлдэхүүн хэсэг бүрийн концентраци нь үр дүнгийн хэсэгт тайлбарласны дагуу туршилтаас туршилтанд харилцан адилгүй байв.Туршилтын үргэлжлэх хугацаа 4 цагаас хэтэрсэн тохиолдолд азидыг 0.02% (w/v) концентрацид ашигласан.LLPS дээжийг ашигласан бүх шинжилгээнд шинжилгээ хийхээс өмнө хольцыг 5 минутын турш тэнцвэржүүлнэ.Гэрлийн тархалтын шинжилгээнд 150 μл дээжийг холбоогүй 96 цооногтой (μClear®, хар, F-Bottom/Chimney худаг, Greiner bio-one, Kremsmünster, Австри) микроплатанд ачиж, наалдамхай хальсаар хучив.LLP-ийг CLARIOstar хавтан уншигч (BMG Labtech, Ортенберг, Герман) дээр уусмалын төв хэсэгт 350 нм-т шингээх чадварыг хэмжих замаар хянасан.Туршилтыг 25 хэмийн температурт гурван удаа хийсэн бөгөөд алдааг дундаж утгаас стандарт хазайлтаар тооцоолсон.Шингэрүүлсэн үе шатыг дээжийн центрифуг болон SDS-PAGE гелийн шинжилгээгээр, шингэрүүлсэн болон төвлөрсөн фаз дахь αS фракцыг LLPS-ийн янз бүрийн уусмалаар хэмжсэн.1 μM AF488 шошготой αS агуулсан 100 мкл LLPS дээжийг сайтар хольж, дараа нь 9600×г-т 30 минутын турш центрифуг хийж, тунадас нь ихэвчлэн харагдахуйц байдлаар бэлтгэгдсэн.Дээд давхаргын 50 мкл-ийг SDS-PAGE гель ашиглан уургийн хэмжээг тодорхойлоход ашигласан.Гельүүдийг ChemiDoc гель дүрслэх систем (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, АНУ) ашиглан AF488 шүүлтүүрээр сканнердсан эсвэл Coomassie будгаар будаж, зохих шүүлтүүрээр дүрсэлсэн.Үүссэн хамтлагуудыг ImageJ хувилбар 1.53i (АНУ, Үндэсний эрүүл мэндийн хүрээлэн) ашиглан шинжилсэн.Туршилтыг ижил үр дүнтэй хоёр өөр туршилтаар давхардсан.
Ихэвчлэн 150 мкл дээжийг холбоогүй 96 цооногтой микроплитуудад хэрэглэж, өрөөний температурт Leica DMI6000B урвуу микроскопоор (Leica Microsystems, Wetzlar, Герман) дүрсэлсэн.Спот туршилтын хувьд µ-Slide Angiogenesis хавтан (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Герман) эсвэл 96 худагтай полистирол микроплитуудыг (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) мөн ашигласан.EL6000 галоген эсвэл мөнгөн усны металл галоген чийдэнг гэрэлтүүлгийн эх үүсвэр болгон ашигласан (BF/DIC болон WF дүрслэлд тус тус).WF микроскопийн хувьд 40 дахин томруулдаг агаарын объектыг (Leica Microsystems, Герман) дээжинд гэрлийг төвлөрүүлж, цуглуулахад ашигласан.AF488 ба ThT шошготой дээжийн хувьд өдөөлт, ялгаралтыг стандарт GFP шүүлтүүрийн багц, өдөөх болон ялгаруулах зурвасын дамжуулалтын шүүлтүүр, 460-500 нм ба 512-542 нм зурвасын шүүлтүүр, 495 нм дихроик толин тусгал бүхий шүүнэ.Atto647N-ээр шошгологдсон дээжийн хувьд 628-40 нм ба 692-40 нм өдөөх болон ялгаруулах зурвасын шүүлтүүр бүхий стандарт Cy5 шүүлтүүр, 660 нм дихроик толь ашигласан.BF болон DIC микроскопийн хувьд ижил ойсон гэрэл цуглуулах объектыг ашиглана.Цуглуулсан гэрлийг Leica DFC7000 CCD камерт (Leica Microsystems, Герман) тэмдэглэв.BF болон DIC микроскопийн дүрслэлд өртөх хугацаа 50 мс, WF микроскопийн дүрслэлд 20-100 мс байв.Харьцуулбал, ThT бүхий бүх туршилтын өртөх хугацаа 100 мс байв.Дуслын нэгдлийг дүрслэхийн тулд цаг хугацааны туршилтыг хийж, 100 мс тутамд зургийг хэдэн минутын турш цуглуулсан.Зургийн шинжилгээнд ImageJ (NIH, USA) ашигласан.Туршилтыг гурван удаа хийсэн бөгөөд ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.
Хамтран нутагшуулах туршилт, FRAP болон 3D сэргээн босголтын хувьд зургийг ZEN 2 цэнхэр хэвлэл (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Герман) ашиглан Zeiss LSM 880 урвуу төвлөрсөн микроскопоор авсан.50 мкл-ийн дээжийг μ-Slide Angiogenesis Петрийн аяганд (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Герман) хэрэглэж, гидрофиль полимерээр (ibiTreat) эмчилж, 63 × тосонд дүрэх объектод суурилуулсан (Plan-Apochromat 63×il/NA 1.4) DIC дээр).Зургийг 458 нм, 488 нм, 633 нм аргон лазерын шугамыг ашиглан 0.26 μм/пикселийн нарийвчлалтай, 8 μс/пикселийн өртөх хугацаатай 470–600–36 нм 2 өдөөх болон ялгаралтыг илрүүлэх цонхоор авсан. болон 638-755 нм-ийг ThT, AF488 болон Atto647N-ийг тус тус дүрслэн харуулахад ашигласан.FRAP туршилтын хувьд дээж тус бүрийн хурдацтай гэрэл зургийг секундэд 1 фрэймийн давтамжтайгаар бүртгэсэн.Туршилтыг гурван удаа тасалгааны температурт хийсэн ижил үр дүнтэй.Бүх зургийг Zen 2 blue edition программ хангамж (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Герман) ашиглан шинжилсэн.FRAP муруйг OriginPro 9.1 ашиглан Zen 2 ашиглан зурган дээрээс гаргаж авсан эрчим/цаг хугацааны өгөгдөлд тохируулан, зурж, тохируулсан.Сэргээх муруйг молекулын тархалтыг тооцохын тулд моно-экспоненциал загварт суулгаж, олж авах цайруулах нөлөөг тооцох нэмэлт экспоненциал нэр томъёог оруулсан.Дараа нь бид D-г нэрлэсэн цайруулах радиус болон өмнө нь тодорхойлсон нөхөн сэргээх хагас задралын хугацааг ашиглан Kang et al.5 35 үзүүлэв.
αS-ийн нэг цистеины хувилбаруудыг 24 (TEMPOL-24-αS) ба 122 (TEMPOL-122-αS) байрлалд 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL)-аар нийлэгжүүлсэн. тус тус.Spin шошгололт EPR туршилтын хувьд αS концентрацийг 100 μM, PEG концентрацийг 15% (w/v) гэж тохируулсан.Төрөл бүрийн нэгтгэх нөхцлийн хувьд αS: pLK харьцаа 1:10 байсан бол αS:ΔNt-Tau болон αS:Tau441 харьцаа 1:1 хэвээр байна.Бөөгнөрөл байхгүй үед холбох титрлэлтийн туршилтын хувьд TEMPOL-122-αS-ийг 50 μM-д байлгаж, поликатионуудыг концентраци нэмэгдэх үед титрлэж, нөхцөл бүрийг тусад нь бэлтгэсэн.CW-EPR хэмжилтийг ~9.7 ГГц-ийн богино долгионы (SHF) давтамж дээр ажилладаг Bruker ER4118 SPT-N1 резонатороор тоноглогдсон Bruker ELEXSYS E580 X зурвасын спектрометр ашиглан хийсэн.Температурыг 25 ° C-д тохируулж, шингэн азотын криостатаар удирддаг.Спектрүүдийг ханаагүй нөхцөлд 4 мВт чадалтай, модуляцын далайц 0.1 мТ, 100 кГц давтамжтайгаар авсан.Тау441 эсвэл ΔNt-Tau (анхны уургийн уусмалд байдаг) агуулсан дээж дэх бууруулагч бодисын үлдэгдэл концентрациас үүдэн дээжийн хоорондох эргэлтийн концентрацийн зөрүү болон болзошгүй эргэлтийн бууралтаас зайлсхийхийн тулд спектрийн эрчмийг хэвийн болгосон.Өгөгдсөн g утгыг Matlab®67-д хэрэгжүүлсэн Easyspin программ хангамж (v. 6.0.0-dev.34) ашиглан гүйцэтгэсэн EPR спектрийн загварчлалын үр дүнд олж авсан.Өгөгдлийг загварчлахад нэг/хоёр бүрэлдэхүүн хэсэг изотроп загварыг ашигласан.Бүх дохиог хэвийн болгосны дараа симуляц бүрийг харгалзах туршилтын спектрээс хасах замаар үлдэгдлийг тооцоолсон.Холболтын титрлэлтийн шинжилгээнд αS-тай поликатионуудын холболтыг хянахын тулд гуравдахь зурвасын нормчлогдсон EPR спектрийн (IIII/III) хоёр дахь зурвасын харьцангуй эрчмийг ашигласан.Диссоциацийн тогтмолыг (Kd) тооцоолохын тулд үүссэн муруйг ойролцоогоор n ижил ба бие даасан холболтын газар гэж тооцсон загварт суулгасан.
NMR спектроскопийн туршилтыг криопроб ба Z-градиентээр тоноглогдсон Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR спектрометр ашиглан хийсэн.Бүх туршилтыг 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, рН 7.4 дахь 130–207 μM αS ба харгалзах αS/ΔNt-Tau болон pLK эквивалентуудыг ашиглан хийсэн ба 15°C температурт гүйцэтгэсэн.LPS-ийг NMR-ээр хянахын тулд урьдчилан хольсон дээжинд 10% PEG нэмсэн.Химийн шилжилтийн цочролын график (Зураг 1b) нь дундаж 1H ба 15N химийн шилжилтийг харуулж байна.αS 2D1H-15N HSQC спектрийг өмнөх даалгаврын дагуу (BMRB оролт #25227) хуваарилж, HNCA, HNCO болон CBCAcoNH-ийн 3D спектрийг бүртгэж, дүн шинжилгээ хийснээр баталгаажуулсан.13Cα ба 13Cβ химийн шилжилтийг ΔNt-Tau эсвэл pLK байлцуулан тооцоолж, цэвэр санамсаргүй ороомгийн конформацийн αS химийн шилжилттэй харьцуулахад хоёрдогч бүтцийн чиг хандлагад гарч болзошгүй өөрчлөлтийг хэмжих 68 (Нэмэлт Зураг 5c).R1ρ хурдыг 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, 800 мс-ийн сааталтай hsqctretf3gpsi туршилтуудыг (Брукерын номын сангаас авсан) бүртгэж хэмжиж, экспоненциал функцуудыг өөр өөр эрчимтэй оргил сааталд тохируулсан. R1ρ ба түүний туршилтын тодорхойгүй байдлыг тодорхойлох хугацаа.
Хоёр өнгөт цаг хугацааны шийдэл бүхий флюресценцийн микроскопын туршилтыг арилжааны цаг хугацааны шийдэл бүхий MT200 флюресцент конфокаль микроскоп (PicoQuant, Берлин, Герман) дээр цаг хугацааны хамаарал бүхий нэг фотон тоолох (TCSPC) төхөөрөмжөөр хийсэн.Лазер диодын толгойг импульсийн хоорондох өдөөлтөд (PIE) ашигладаг бөгөөд цацраг нь нэг горимын долгионы дамжуулагчаар дамждаг бөгөөд 481 нм ба 637 нм лазерын шугамын хувьд 10-аас 100 нВт-ын лазерын хүчийг дихроик толины дараа хэмждэг.Энэ нь фотоныг тоолох оновчтой хурдыг баталгаажуулж, фотоныг ялгах, гэрэл гэгээтэй болгох, ханасан байдлын нөлөөллөөс зайлсхийдэг.μ-Слайд ангиогенезийн бүрхүүл буюу ялтсуудыг (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Герман) залруулах хүзүүвчтэй Super Apochromat 60x NA 1.2 линз (Olympus Life Sciences, Waltham, АНУ) дээр шууд дүрэх усанд байрлуулсан.488/640 нм дихроик толь (Semrock, Lake Forest, IL, USA) нь үндсэн цацраг задлагч болгон ашигласан.Фокусгүй цацрагийг 50 микрон диаметртэй нүхээр хааж, дараа нь төвлөрсөн цацрагийг 50/50 цацраг задлагчаар 2 илрүүлэх замд хуваана.Илрүүлэгчийн урд талд ногоон өнгөт (AF488) 520/35, улаан өнгөний хувьд 690/70 (Atto647N) ялгаралтын шүүлтүүрийг (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ашигласан.Нэг фотоны нуранги диодыг (SPAD) (Micro Photon Devices, Болзано, Итали) илрүүлэгч болгон ашигласан.Мэдээлэл цуглуулах, дүн шинжилгээ хийх хоёрыг худалдаанд байгаа SymphoTime64 програм хангамжийг (PicoQuant GmbH, Берлин, Герман) ашиглан гүйцэтгэсэн.
50 микролитр LLPS дээжийг μ-Slide ангиогенезийн цооногуудад хэрэглэсэн (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Герман).Үүссэн зургуудыг худгийн ёроолоос 20 μм-ийн өндөрт төвлөрүүлж, унжсан дуслууд нь оновчтой ажиллах зайд, тэнхлэгийн нарийвчлал нь 0.25 μм/пикселээс багагүй, саатал нь 400 мкм/пикселтэй сал болон цэгүүдийн хувьд ~1 μм байна.Суваг тус бүрийн арын дохионы дундаж эрчим (PBG, дундаж + 2σ) дээр тулгуурлан эрчмийн босго тавьж өгөгдлийг сонгох ба ингэснээр зөвхөн шингэн уургийн дусал, сал, толбо сонгогдож, тархсан фазын аль ч боломжит гарал үүслийг шүүнэ.Суваг тус бүрийн төрөл зүйл (τ) (ногоон, AF488-ийн хувьд “g” ба улаан, Atto647N-ийн хувьд “r”)-ийн амьдрах хугацааг шинжлэхийн тулд бид дусал, сал, толбо агуулсан сонирхлын бүсүүдийг (ROI) сонгосон (Нэмэлт Зураг 1). ).8б) ба тэдгээрийн насан туршийн задралыг (дусал, сал эсвэл толбоны хувьд τD, τR ба τP тус тус, Нэмэлт зураг 8в-г үзнэ үү) сүүлний тохируулга болон хоёр бүрэлдэхүүн хэсэгтэй задралын загварыг ашиглан суваг бүрт тохируулан гаргаж авсан.Дундаж τ -аас τ .Олон экспоненциал тохируулгад хэт цөөн фотон үйлдвэрлэсэн ROI-ийг шинжилгээнд хамруулаагүй.Ашигласан таслалтыг сал ба цэгүүдэд <104 фотон, дусалд 103 фотон ашигласан.Зургийн талбар дахь дуслууд нь ихэвчлэн жижиг, цөөн байдаг тул илүү их эрчимтэй ялзралын муруйг олж авахад хэцүү байдаг тул дуслууд нь бага босготой байдаг.Фотоны хуримтлалын хязгаараас (>500 тоо/пиксел гэж тохируулсан) фотоны тоотой ROI-г мөн шинжилгээнд хаясан.Сонирхсон бүс нутгаас олж авсан эрчмийн задралын муруйг үйлчилгээний амьдралын эхнээс хамгийн ихдээ 90%-ийн эрчимтэй (ялзалтын хамгийн их эрчмийн дараа бага зэрэг) тааруулж, IRF-ийн хөндлөнгийн оролцоог хамгийн бага байлгахын зэрэгцээ бүх эрчмийн бууралтад ижил байх болно. тохиргоонууд Харьцангуй цагийн цонх Сал болон толбоны хувьд 25-50 ROI, дуслын хувьд 15-25 ROI-д дүн шинжилгээ хийж, дор хаяж 3 бие даасан туршилтаас бүртгэгдсэн 4-өөс дээш давталтаас авсан зургуудаас сонгосон.Хоёр сүүлт t-тестийг төрөл зүйлийн хоорондын эсвэл коацерват системийн хоорондох статистикийн ялгааг үнэлэхэд ашигласан.Амьдралын хугацааг (τ) пикселээр пикселээр шинжлэхийн тулд суваг тус бүрийн талбар дээрх ашиглалтын хугацааны нийт унтралтыг тооцоолж, 2/3 бүрэлдэхүүн хэсэгтэй экспоненциал сулралтын загварыг ойролцоолсон болно.Дараа нь пиксел бүрийн насан туршийн унтралтыг өмнө нь тооцоолсон τ утгыг ашиглан тохируулсан бөгөөд үүний үр дүнд хуурамч өнгөт FLIM тохирох дүрс гарч ирэв.Нэг сувгийн бүх зураг дээр сүүлтэй таарах насан туршийн хүрээ ижил байсан бөгөөд ялзрал бүр нь найдвартай тохирохуйц хангалттай фотон үүсгэдэг.FRET шинжилгээний хувьд 100 фотоны бага эрчимтэй босго ашиглан пикселүүдийг сонгосон бөгөөд энэ нь 11 фотоны дэвсгэр дохиог (FBG) дунджаар авсан.Суваг бүрийн флюресценцийн эрчмийг туршилтаар тодорхойлсон залруулгын хүчин зүйлсээр зассан: 69 спектрийн хөндлөн огтлолцол α 0.004, шууд өдөөх β 0.0305, илрүүлэх үр ашиг γ 0.517.Дараа нь пикселийн түвшний FRET үр ашгийг дараах тэгшитгэлийг ашиглан тооцоолно.
Энд FDD нь донор (ногоон) сувагт ажиглагдсан флюресценцийн эрчим, FDA нь шууд бус өдөөлтийн үед хүлээн авагч (улаан) сувагт ажиглагдсан флюресценцийн эрчим, FAA нь шууд өдөөлтийн үед хүлээн авагч (улаан) сувагт ажиглагдсан флюресценцийн эрчим юм. PIE).Флюресценцийн эрчмийн импульс сувагт ажиглагдаж байна).
25 μМ шошгогүй мономер Tau441 (25 мкМ αS-тай эсвэл агуулаагүй) агуулсан 100 μл LLPS урвалын уусмалыг LLPS буферт (дээр дурдсанчлан нэмэлт) наалдамхай тугалган бүрээстэй, дусал үүсэхийг WF микроскопоор шалгасны дараа холбоогүй 96 цооногтой микроплитууд дээр хийнэ. тэнцвэржүүлэх.10 минутын дотор.Өрөөний температурт 48 цагийн турш инкубацийн дараа уургийн сал, толбо байгаа нь батлагдсан.Дараа нь худагнаас салон дээрх шингэнийг болгоомжтой авч, дараа нь 50 л диссоциацийн буфер (10 мм HEPES, рН 7.4, 1 М NaCl, 1 мм DTT) нэмээд 10 минутын турш өсгөвөрлөнө.Давсны өндөр концентраци нь PEG-ийн үлдэгдэлээс болж LLPS дахин давтагдахгүй бөгөөд зөвхөн электростатик харилцан үйлчлэлийн үр дүнд үүссэн уургийн нэгдлүүдийг задлах болно.Дараа нь худгийн ёроолыг микропипеткийн үзүүрээр сайтар хусаж, үүссэн уусмалыг ажиглалтын хоосон худаг руу шилжүүлэв.Дээжийг 50 μM ThT-ээр 1 цагийн турш инкубацийн дараа тусгаарлагдсан толбо байгаа эсэхийг WF микроскопоор шалгасан.300 мкл 70 мкМ αS уусмалыг PBS-д рН 7.4, 0.01% натрийн азидыг 37 °C температурт, 200 эрг/мин хурдтайгаар тойрог замын сэгсрэгч дээр 7 хоногийн турш өсгөвөрлөх замаар дууны долгионы αS фибрилүүдийг бэлтгэнэ.Дараа нь уусмалыг 9600 × г-т 30 минутын турш центрифуг хийж, үрлийг PBS рН 7.4-д дахин түдгэлзүүлж, дуу авианы долгионоор хийсэн (1 мин, 50% цикл, Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Ньютон, АНУ) фибрилийн дээжийг дуу авианд шилжүүлэв. жижиг фибрилүүдийн харьцангуй жигд хэмжээтэй тархалттай.
PIE горимыг ашиглан FLIM-FRET бичил харуурын туршилтанд ашигласан ижил MT200 цаг хугацааны шийдэл бүхий флюресцент конфокаль микроскоп (Пико-Квант, Берлин, Герман) дээр FCS/FCCS шинжилгээ болон хоёр өнгөт давхцлыг илрүүлэх (TCCD) хийсэн.Эдгээр туршилтуудад зориулсан лазерын хүчийг 6.0 мкВт (481 нм) ба 6.2 мкВт (637 нм) дээр нэмсэн.Эдгээр лазерын хүчийг хослуулан хэрэглэсэн хос флюорофорын хувьд ижил төстэй гэрэлтүүлгийг гаргаж, тооллогын оновчтой хурдыг олж, гэрэл гэгээ, ханалтаас зайлсхийх зорилгоор сонгосон.Мэдээлэл цуглуулах, дүн шинжилгээ хийх хоёрыг худалдаанд гарсан SymphoTime64 хувилбар 2.3 програм хангамж (PicoQuant, Берлин, Герман) ашиглан гүйцэтгэсэн.
LLPS ашиглан олж авсан тусгаарлагдсан αS/Tau дүүргэгчийн дээжийг тусгаарлах буферт тохирох мономолекулын концентрацид шингэлнэ (ихэвчлэн 1:500 шингэрүүлэлт, учир нь коацерват дээжээс тусгаарлах үед дүүргэгчид аль хэдийн бага концентрацитай байдаг).Дээжийг 1 мг/мл концентрацитай BSA уусмалаар урьдчилан бүрсэн бүрхүүлд (Корнинг, АНУ) шууд хэрэглэсэн.
Ногоон ба улаан сувгууд дахь PIE-smFRET шинжилгээний хувьд мономер үйл явдлаас үүдэлтэй бага эрчимтэй дохиог шүүхээр 25 фотоноос бага эрчимтэй босгыг ашигласан (тусгаарлагдсан дүүргэгчтэй харьцуулахад мономерууд нэгтгэсэн дээжээс илүү байгааг анхаарна уу).Шинжилгээнд зориулж дүүргэгчийг тусгайлан сонгохын тулд энэ босгыг цэвэр мономер дээжийн шинжилгээнээс авсан мономер αS-ийн дундаж эрчмээс тав дахин их хэмжээгээр тооцсон.PIE хөтчийн хэлхээ нь TSCPC өгөгдөл цуглуулахтай хамт дэвсгэр болон спектрийн хөндлөн огтлолцлыг арилгахад тусалдаг насан туршийн жинлэх шүүлтүүрийг ашиглах боломжийг олгосон.Дээрх босгыг ашиглан сонгосон галын эрчмийг зөвхөн буферийн дээжийн эрч хүч/бинтэй харьцуулсан тохиолдлын гистограммаас тодорхойлсон дундаж дэвсгэр дохиог ашиглан зассан.Том дүүргэгчтэй холбоотой тэсрэлт нь ихэвчлэн хугацааны дараалсан хэд хэдэн хогийн савыг эзэлдэг (1 мс-ээр тохируулсан).Эдгээр тохиолдолд хамгийн их хүч чадлын савыг сонгосон.FRET болон стехиометрийн шинжилгээнд онолын хувьд тодорхойлогдсон гамма хүчин зүйл γ (0.517) -ийг ашигласан.Ашигласан өдөөх лазерын хүчин чадлаар спектрийн хөндлөн огтлолцол болон шууд өдөөлтөд үзүүлэх хувь нэмэр бага (туршилтаар тодорхойлогддог).Тэсрэлт дэх FRET-ийн үр ашиг ба стехиометрийг дараах байдлаар тооцоолно.