Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.
Слайд бүрт гурван өгүүллийг харуулсан слайдерууд.Слайдуудын дундуур шилжихийн тулд буцах болон дараагийн товчлууруудыг, слайд бүрээр шилжихийн тулд төгсгөлд байрлах слайд хянагчийн товчлууруудыг ашиглана уу.

Бүтээгдэхүүний тодорхойлолт

Зэвэрдэггүй ган 347L ороомог хоолой, Ган зэрэг: SS347L

Дасан зохицох дархлааны хариу урвал эхлэхээс өмнө эзэн хүний ​​төрөлхийн хамгаалалтын систем нь интерферон (IFNs) гэж нэрлэгддэг ялгарсан альфа-спираль цитокинуудын гэр бүлээр дамждаг нянгийн эсрэг хариу үйлдэл үзүүлдэг.
Идэвхжүүлсэн I төрлийн интерферон рецепторын цогцолборууд (IFNAR1 ба IFNAR2) нь Janus kinases TYK2 ба JAK15,6-ийн зуучлалын дохионы дамжуулалтын каскадыг өдөөдөг нь тогтоогдсон.Эдгээр Janus kinases нь SH2 домэйн гетеродимержилтийг эхлүүлэхийн тулд тирозин үлдэгдэл дээр дохио хувиргагч болон транскрипцийн уургийн идэвхжүүлэгчийг (STAT1 ба STAT2) фосфоржуулж байна6.
Вирусын халдвараас хамгаалах эхний шугамын хувьд эсүүд нь биологийн өргөн хүрээний үйл ажиллагаа бүхий эсийн уургийн өргөн хүрээтэй харилцан үйлчлэлийг хурдан нэвтрүүлдэг.Олон уураг нь нэг буюу хэд хэдэн цитокинуудтай харилцан үйлчилж, бүрэн үйл ажиллагааг хангадаг тул ISG нь шууд харилцан үйлчилдэг эсвэл тэдгээрийн харилцан үйлчлэл нь эсийн уурагаар дамждаг гэж ерөнхийд нь хүлээн зөвшөөрдөг.Дархлаа тунадасжилтыг ашиглан бид цэврүүттэй холбоотой уураг болох VAPA-ийг холестеролоор дамждаг вирүсийн боловсорч гүйцэхэд зуучилдаг IFITM1/2/3-тай харилцан үйлчлэгч болохыг тодорхойлсон бөгөөд энэ нь мөөгөнцрийн хоёр эрлийз системийг ашигласан өөр судалгаагаар батлагдсан.
Халдвар, хорт хавдрын өөрчлөлтийг дарах биологийн үндсэн үйл явц нь үндсэн гистокомпатын цогцолбор (MHC) молекулуудаар дамждаг эсрэгтөрөгчийн илрэл юм.


Flo-1 эсүүд нь улаан хоолойн хавдрын гол шинж чанарыг дуурайдаг тул улаан хоолойн аденокарциномын хамгийн сайн мэддэг in vitro загваруудын нэг юм22,23.Гэсэн хэдий ч бүх хавдар дархлаа үүсгэдэггүй бөгөөд Flo-1 эсүүд интерфероны эмчилгээнд хариу үйлдэл үзүүлэх эсэхийг тодорхойлохын тулд бид Flo-1 эсийг 10 нг/мл IFNα-аар 72 цагийн турш эмчилсэн.Flo-1 эсүүд нь pSTAT1 ба IRF1-ийг эрт өдөөж, эмчилгээ хийснээс хойш 2 цагийн дараа эхэлж, 72 цагийн турш үргэлжилсэн, IRF1-ийн хөдөлгөөнгүй түвшин цаг хугацаанаас хамаарч буурсан байна (Зураг 1А).Хамтдаа, эдгээр үүрэн загвар нь Интерфероны хариуг судлахад ашиглаж болно.
(C) Төлөөлөгч иммуноблотыг ижил дээжээс p53(DO-1) эсрэгбиемээр шинжилж, уургийн хөндлөн холбоосын зэргийг үнэлэв.
Бид уургийн харилцан үйлчлэлийн ландшафтыг авахын тулд мембраны өндөр нэвчилт, харьцангуй богино урвалын хугацаатай тул өргөн хэрэглэгддэг DSS-ийг ашигласан.Богино урвалын хугацаа нь хөндлөн холбосон уургийн том агрегатууд үүсэхээс сэргийлж, улмаар хөндлөн холбогчийг тогтвортой байлгахад тусалдаг.Хамгийн оновчтой DSS-ийн концентрацийг тодорхойлж, хэт хөндлөн холбоос үүсгэхгүйн тулд бид эхлээд эсүүдийг 5, 2.5, 1 мм DSS-д 5, 10, 5, 30 минутын турш тус тус гаргаж, Лизатуудыг Coomassie-ээр будсан SDS-PAGE-д шинжлэв. (Мэдээллийг харуулаагүй).Эсийн лизууд хамгийн бага концентрацид өндөр концентрацид, хамгийн богино хугацаанд холбоотой байдаг.Тиймээс, DSS-ийг 1, 0.5, 0.5, 0.1 мм-ээс дээш 5 минут гаруй (зураг 1b).Нэмж дурдахад P53 (DO-1) P53 (DO-1) нь уураг хөндлөн хөндлөн огтлолын зэрэгтэй харьцуулахын тулд барууны цохилтыг харуулж байна.
MS / MS SPECTRA дараа нь уураг дараалсан дарааллаар таарч, maxquant26,27-тай тохирч байна.SIM-XL нь энгийн эсвэл нарийн төвөгтэй уургийн холимог дахь уураг-уургийн харилцан үйлчлэл, дотоод гинж, бие даасан гинжийг тодорхойлж, уургийн бүтэц дэх харилцан үйлчлэлийг дүрслэн харуулах скриптүүдийг өгдөг.Нэмж дурдахад MS / MS29 Spectrum-ийн дагуу ID-ийн онооны дугаарыг ID-ийн оноог багтаасан болно.Хэд хэдэн өндөр найдвартай уураг-уургийн харилцан үйлчлэл, цогцолборыг тодорхойлж, молекулын динамик (МД) загварчлалыг ашиглан цогцолборуудын хамтын дархлаажуулалт ба конформацийн өөрчлөлтийг ашиглан харилцан үйлчлэлийн шинэ багцыг цаашид судалсан (Зураг 2) 30, 31.
CLMS аргын бүдүүвч тойм.Хүлээн авсан спектрүүдээс Crosslinked Peptides (SIM-XL) програмын спектрийг таних машиныг ашиглан холбогдсон хоёр пептидийг тодорхойлж, бүх нэгдлүүдийг тооцооллын дамжуулах хоолойг ашиглан цогц сүлжээнд нэгтгэв.Хэд хэдэн шинэ өндөр нарийвчлалтай уураг-уургийн харилцан үйлчлэлийг дархлааны тунадасжилтыг ашиглан баталгаажуулж, молекулын динамик (MD) загварчлалын тусламжтайгаар цогцолбор дахь конформацийн өөрчлөлтийг шалгасан.
Нийтдээ ~30,500 ба ~28,500 пептидийг MaxQuant ашиглан өдөөгдөөгүй болон өдөөгдсөн IFNα дээжинд тус тус илрүүлсэн (Нэмэлт хүснэгт S1, Зураг 3А).Хоёр тохиолдолд пептидийн уртын тархалт нь илүү том пептидийн эзлэх хувь өндөр байгааг харуулсан нь хөндлөн холбоос бүхий пептидүүд байгааг харуулж байна (Зураг 3B,C).Reactome замын мэдээллийн санг ашиглан IFNα эмчилгээний хариуд гурваас дээш дахин баяжуулсан уургийн замуудын шинжилгээ нь MHC-I-ээр үүсгэгдсэн антигенийг нэвтрүүлэх, боловсруулах нь хамгийн давамгайлсан зам болохыг харуулсан (Зураг 3E).Өмнөх мэдээллүүдтэй нийцүүлэн OAS ба ISG15-аар зуучлагдсан вирусын эсрэг хариу үйлдэл, түүнчлэн IFNα/β болон цитокины дохиолол идэвхжсэн замуудын дунд байсан.Нэмэлт, лизин- лизин, серин-Тодорхой маягийн уураг ашиглан анх олж авсан MS / MS SPECTRA-г анх удаа олж авсан MS / MS SPECTA-ыг тодорхойлжээ.Саяхны судалгаагаар 5 төрлийн эсийн ISG-ийн хэт экспрессийн судалгааны мета-шинжилгээгээр 9 төрлийн вирусын 20 вирусыг хамарсан 104 ISG-г мэдээлсэн байна9.
(A) IFNα14 боловсруулсан болон боловсруулаагүй Flo-1 дээжинд тодорхойлсон нийтлэг ба онцгой пептидийн тоог харуулсан Венн диаграм.
Интерфероноор зуучлагдсан ISG-ийн өдөөлтийг сайн баримтжуулсан боловч молекулын түвшинд эдгээр уургууд нь биологийн өргөн хүрээний үйл ажиллагааг хэрхэн төгсгөдөгийг сайн ойлгодоггүй.Сонирхолтой нь бид MX1, USP18, ROBO1, OAS3, STAT1 уураг агуулсан сүлжээг илрүүлсэн бөгөөд тэдгээр нь IFNα эмчилгээний хариуд том цогцолбор үүсгэдэг (Зураг 4, Хүснэгт S2) 32,33,34.Хамгийн чухал нь эдгээр харилцан үйлчлэл нь IFNα-тай эмчилсэн бүх гурвалсан хувилбаруудад илэрсэн бөгөөд боловсруулаагүй дээжинд илрээгүй нь IFNα эмчилгээний хариуд тусгайлан үүссэн болохыг харуулж байна.Эдгээр α-helcey нь харилцан үйлчлэлийг давамгайлж буй гидрофилийн гадаргуугийн гадаргуугийн талбайг бүрдүүлдэг.Бидний өгөгдөл нь USP18 катализаторын домэйн нь STAT1 DBD-тэй харилцан үйлчилдэг болохыг харуулсан (Зураг 4A,D) Энэ нь STAT1 ба STAT2 хоёулаа USP18-ийг IFNAR2-д татахад үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.
Өөр өөр тэмдэгтүүдийн домэйн домэйн нь өнгөт32-ийг тэмдэглэсэн. MX1 домэйн, domnamin_n (73-249), dynamin_n (259-547), GED (569-547), GED (569-560).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ба fn3 (777–864).Хөндлөн холбоосын босгыг 3.5 гэж тогтоосон.Цэгний графикууд нь MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) болон OAS3 (F) -тай STAT1-ийн харилцан үйлчлэлийн цэгүүд, мөн хоёр пептидийн хоорондох K эсвэл S харилцан үйлчлэлийн цэгүүдийг заана.Зураг дээр хөндлөн холбоосын онооны босго 3.0 байна.) програм.
Нэмж дурдахад N-төгсгөл нь бүтэцгүй бөгөөд изопептидазын идэвхжил, ISG1537-ийн холболтыг шаарддаггүй гэж таамаглаж байсан.IFNAR2-ыг холбох газар нь үлдэгдэл 312-368 хооронд байрладаг ба ялангуяа цогцолбор дахь уурагуудын аль нь ч энэ бүстэй холбогддоггүй (Зураг 4А) 37,38.Эдгээр өгөгдлийг хамтад нь хүлээн авсан ifnar2 IFNAR2 Binding Domain нь зөвхөн рецептор уураг хэрэглэдэг гэдгийг харуулж байна.

Олигоаденилат синтаза (OAS) уургийн гэр бүл нь эсийн доторх давхар судалтай РНХ (dsRNA) хүлээн авч, холбож, бүтцийн өөрчлөлтөд орж, 2′,5′-тэй олигоаденилатыг (2-5 As) нийлэгжүүлдэг 40 .SH2 ба Stat1-ийн хоорондох OAS3-ийн DII ба DII ба DIII домэйн домэйн нь CCD ба ST2 ба STAT1 TAD-ийн хоорондох (Зураг 4а, F).Нэмж дурдахад, GTPASE MX1-ийн N терминалын домэйн Домэйн домэйн нь OAS3-ийн OAS3-тэй тэнцэхүйц байдлаар харьцдаг (Зураг 4A).
MX уургууд нь GTP-ийг холбож, гидролиз болгодог N-терминал GTPase домэйн, өөрөө угсрах зуучлалын завсрын домэйн, GTPase (LZ) үүрэг гүйцэтгэдэг C-терминал лейцин цахилгаан товч агуулсан том динеинтэй төстэй GTPase-ийн нэг хэсэг юм. ).домэйн эффектор домэйн25,43.Өмнө нь мэдээлсэн мөөгөнцрийн хоёр эрлийз дэлгэц нь PIAS1-тэй холбоотой MX1 нь ДНХ-тай холбогдох идэвхийг хааж, STAT1-зуучлагдсан генийн идэвхжүүлэлтийг дарангуйлдаг бөгөөд мөн SUMO E344,45 лигазын идэвхжилтэй болохыг харуулсан.Энд бид MX1 нь STAT1-тэй холбогддог болохыг харуулж байна (Зураг 4C,D), гэхдээ энэ харилцан үйлчлэл нь IFNα-ийн хариуд STAT1-зуучлагдсан генийн идэвхжилд хэрхэн нөлөөлж байгааг цаашид судлах шаардлагатай.Үүнээс гадна MX1 нь ifn3 болон DDX6, DDX6-тэй IFIT3 ба DDX60-тэй харьцуулсан болохыг олж мэдэв.
DDX60 нь IFN-ээр өдөөгдсөн цитоплазмын геликаз бөгөөд вирусын RNA46-ийн RIG-I-ээс хамааралгүй задралд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэж өмнө нь мэдээлж байсан.Энэ нь RIG-I-тэй харилцан үйлчилж, дохиололыг нь лиганд өвөрмөц байдлаар идэвхжүүлдэг 46. DDX60 нь DEXD/H-Box helicase домэйн болон вирусын РНХ болон ДНХ47-г холбодог C-терминал геликаза домайнуудаас бүрдэнэ.Хамгийн их харилцан үйлчлэлийн ихэнх харилцан үйлчлэлийн ихэнх нь Canifical Domains эсвэл Motife-тэй холбоотой хамгийн урт хугацааны харилцан үйлчлэлийн ихэнх нь.Ifit3 нь Rig-i-ийн эерэг модулятор гэж үзсэн бөгөөд би дохио өгч, мавсын цогцолборын бүрэлдэхүүн хэсэг юм.
Протеомыг бүхэлд нь скрининг хийх нь тооцооллын хувьд эрчимтэй явагддаг тул бид хүний ​​UniProt мэдээллийн санг бүхэлд нь IFNα-аар эмчилсэн давталтын аль нэгийг нь шалгаж үзсэн.Энэ хуулбаранд бид HLA-A-ийн хувьд маш их найдвартай харилцан үйлчлэлийн сүлжээг олсон.MS/MS спектрээр тодорхойлсон уургийн замын шинжилгээ нь MHC-I-д суурилсан эсрэгтөрөгчийн боловсруулалт ба танилцуулга нь интерфероноор өдөөгдсөн гол зам болохыг харуулсан (Зураг 3D).HLA нь α1, α2 ба α3 ба α3 ба α3 ба гэрлийн гинж, микроглобулин Β2 (β2m) нь байнгын chaperone нь тогтмол chaperone protein49 юм.Эндоплазмын торлог бүрхэвчинд угсарсны дараа HLA нь пептидийн лиганд байхгүй үед тогтворгүй байдаг50.IFNα байгаа үед бид хоёр HLA-A цогцолборыг илрүүлсэн: нэг нь HMGA1 ба H2B (Зураг 5, Хүснэгт S3), нөгөө нь MDN1, LRCH4, H2B-тай харилцан үйлчилдэг (Зураг 6).
(A) H2B-HLA-A-HMGA1 цогцолбор дахь харилцан үйлчлэлийн янз бүрийн хэлбэрийг дүрсэлсэн 2 хэмжээст дүрслэл (SIM-XL програм хангамжид үүсгэгдсэн): харилцан холболт (цэнхэр), харилцан холболт (улаан) ба нэг холбоос (хар)..Хөндлөн холбоосын босгыг 3.5 гэж тогтоосон.DOT Clops нь HLA-ийн харилцан үйлчлэлийг h2b (B) ба HMGA1 (C), HMGA1 (C) ба HMGA1 (C) ба хоёр пептидын хоорондох харилцан үйлчлэлийн сайтууд.Зураг дээр хөндлөн холбоосын онооны босго 3.0 байна.(D) PMAL-ийн хөтөлбөрт харуулсан уургийн бүтэц хоорондын харилцаа.Эдгээр бүтцийг Phyre2 сервер (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ашиглан загварчилсан ба H2B, HLA-A болон HMGA1 уургуудын загвар бүтэц нь тус тус 1kx552, 1kj349, 2eze55 байв.
Ifnα нь HLA-A харилцааг өдөөдөг H2B (H2BFS), MDN1 ба LRCH4-тэй харилцах харилцааг өдөөдөг.(A) Молекул доторх (улаан) ба молекул хоорондын (цэнхэр) хөндлөн холбоосыг MDN1-ийг тойрог хэлбэрээр дүрсэлсэн 2 хэмжээст интерактив газрын зураг (SIM-XL програм хангамжид үүсгэсэн) дээр үзүүлэв.Хөндлөн холбоосын босгыг 3.5 гэж тогтоосон.Эдгээр бүтцийг Phyre2 сервер (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ашиглан H2B, HLA-A, LRCH4, MDN1 уургуудад зориулсан 1kx552, 1kj349, 6hlu62, 6i2665 загвар бүтэцтэй загварчилсан. тус тусад нь.
Геномын бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахаас гадна Histone H2b нь транскриптинг хийхэд оролцдог.H2B уураг нь гогцоогоор тусгаарлагдсан гурван α-спираль болон С төгсгөлийн сүүлээр үүсгэгдсэн төв гистоны домайн (HFD) -аас бүрдэнэ 41,52.H2B-ийн ихэнх харилцан үйлчлэл нь HFD HFD гетеродимераар шүргэх боломжийг олгодог α1 helix-д тохиолддог.Хэдийгээр лизинүүд нь ДНХ-ийг холбоход оролцдог боловч зарим лизин нь ацетилизаци эсвэл метилизацийн өөр газар юм.Жишээлбэл, H2B-ийн K43, K46, K57 үлдэгдэл нь ДНХ-г шууд холбоход оролцдоггүй, харин транскрипцийн дараах янз бүрийн өөрчлөлтүүдийн бай болдог53.Үүний нэгэн адил H2B дахь K44, K47, K57 үлдэгдэл нь IFNα, түүний дотор бусад уурагтай харилцан үйлчлэлцэх үед өөр үүрэг гүйцэтгэдэг (Зураг 5A, B).Нэмж дурдахад, хромосомын гадуурх гистон H2B нь янз бүрийн төрлийн эсийн дархлааны хариу урвалыг идэвхжүүлж, халдварт бодис эсвэл гэмтсэн эсээс гаралтай давхар хэлхээтэй ДНХ (dsDNA) хэсгүүдийг илрүүлэх цитозол мэдрэгч үүрэг гүйцэтгэдэг54.Эдгээр өгөгдөл нь транскрипцийн зохицуулалтаас үл хамааран өөр физиологийн функцэд H2B-ийн үүргийг тусгадаг.
Энэ нь хүчиллэг C-терминал сүүлтэй ба AT дэгээ гэж нэрлэгддэг гурван ялгаатай DBD-тэй байдаг, учир нь тэдгээр нь dsDNA55,56 дахь AT-аар баялаг бүсийн жижиг ховилтой холбогддог.С-терминалын сүүл нь уураг-уургийн харилцан үйлчлэл, транскрипцийн хүчин зүйлсийг бүрдүүлэхэд оролцдог гэж үздэг, учир нь С-терминал устгах мутантууд транскрипцийг эхлүүлэх боломжгүй байдаг57.Бид C-терминалын домэйноос гадуур HMGA1-тэй HLA-A болон H2B харилцан үйлчлэлийг ажигласан нь С-терминал домэйн нь транскрипцийн хүчин зүйлийг холбоход голчлон ашиглагддаг болохыг харуулж байна (Зураг 5A, C).HMGA уураг нь адаптер ДНХ-тэй холбогдохын тулд гистон Н1-тэй өрсөлдөж, улмаар хүртээмжийг нэмэгдүүлдэг57.Үүний нэгэн адил HMGA нь гистон Н1-тэй өрсөлдөж холбогч ДНХ-ийн дагуу гистон H2B-тай харилцан үйлчилдэг бололтой.HMGB1 нь дендрит эсүүдэд HLA-A, -B, -C-ийн илэрхийлэлийг өдөөж, тэдгээрийг идэвхжүүлэхэд хүргэдэг59, гэхдээ HMG болон HLA хоорондын харилцан үйлчлэлийн талаар өмнө нь мэдээлээгүй байна.Бидний гарт HLA-A нь цөмд байршсан болох нь тогтоогдсон (мэдээлэл харуулаагүй) бөгөөд H2B болон HMGA1 нь цөмд байдаг тул энэ харилцан үйлчлэл нь цөмд тохиолддог.H2B, HLA-A болон HMGA1-ийн хооронд хэмжсэн тусгай нэмэлтүүдийг Зураг 5D-д үзүүлэв.
Эдгээр жишээний аль нэгэнд нь бид HLA-ийг эмх цэгцгүй n-терминал сүүлтэй харьцуулж үзсэн.LRCH4 TLR4 идэвхжүүлэлт, LPS CYTOKINE болон LPS CYTOKING INFICATUNT-ийг indakuction, ингэснээр ингэснээр ингэснээр ингэснээр ингэснээр Innove-ийн хариу урвалын хариу урвалын хариу үйлдэл.Энэ нь есөн лейцинээр баялаг давталт (LRRs) ба эктодомайн дахь калмодулин (CH) гомологийн мотив бүхий мембран уураг бөгөөд дараа нь трансмембран домэйн (TMD) 60, 62.Эмх замбараагүй бүс нутгуудын уураг-уургийн сүлжээ, цэврүүт тээвэрлэлтийн зуучлагчийн үүрэг дээр үндэслэн 63 уургийн харилцан үйлчлэлийн ихэнх нь эмх замбараагүй бүс нутагт явагддаг болохыг олж мэдсэн.
MDN1-ийг HLA-ийн уурагны нэг хэсэг гэж тодорхойлсон (Зураг 6a).Энэ нь уургийн AAA гэр бүлд хамаардаг (өөр өөр үйл ажиллагаатай холбоотой ATPase).Энэ нь 60S 64 рибосомын дэд нэгжээс угсрах хүчин зүйлийг зайлуулж, гексамер цагираг болгон зохион байгуулдаг ижил N-терминал AAA домэйн юм.MDN1 нь том хэмжээтэй (ойролцоогоор 5600 амин хүчил) бөгөөд сайн судлагдсан уурагтай ижил төстэй хязгаарлагдмал байдаг тул хүний ​​бүтэц, үйл ажиллагааны талаар бага мэддэг.Эдгээр гурван уураг нь AAA домэйнтэй харьцдаг бөгөөд Дино домэйнтэй харьцдаг бөгөөд домэйнтэй харьцдаг бөгөөд магадгүй Midas MDN1 домэйнтэй харьцдаг.Нэмж дурдахад саяхан хийгдсэн судалгаагаар HCT116 эсүүд дэх MDN ба HLA-B-ийн хоорондын харилцан үйлчлэлийг нягтралаар цэвэршүүлсэн масс-спектрометр ашиглан мэдээлсэн нь бидний үр дүнг баталж байна68.Ifnα-эмчилсэн дээж дэх энэ цогцолборыг таних тэмдэг нь MDN1 Interferon дохиоллын үүрэг гүйцэтгэдэг.
HLA генүүд нь маш полиморф байдаг тул бид Flo-1 эсийн РНХ дарааллын өгөгдлөөс HLA-A, -B, -C-ийн зураглалыг уншсан дарааллыг гаргаж авсан (өгөгдлийг харуулаагүй).Дараалсан заалттай нийцсэн пептидийн дараалал нь HLA-A-д хөндлөн холбоос бүхий пептидүүд байршсан бүс нутгуудад HLA-A, -B, ба -C-ийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгааг илрүүлсэн (Зураг S3).Үүнээс гадна H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 уурагтай HLA-B/C молекулуудын уураг-уургийн хөндлөн холбоосыг бид ажиглаагүй.HLA-A-д тодорхойлсон пептидүүд нь IFNα-тай эмчилсэн болон боловсруулаагүй дээжинд өндөр эрчимтэй байсан.
Энд тодорхойлсон харилцан үйлчлэл нь орон зайн ойролцоо орших хоёр уургийн өвөрмөц бус хөндлөн холбоосоос шалтгаалаагүй гэдгийг баталгаажуулахын тулд бид дархлааны тунадасжилтын шинжилгээг хийснээр HLA-A харилцан үйлчлэлийн хоёр шинэ хүчин зүйлийг баталгаажуулсан.Эндоген MDN1 ба H2B-тай HLA-A-ийн харилцан үйлчлэлийг IFNα-тай эмчилсэн болон боловсруулаагүй Flo-1 эсийн аль алинд нь илрүүлсэн (Зураг 7, Зураг S4).Гэсэн хэдий ч бидний өгөгдөл нь IFNα нь HLA-A-ийн H2B ба MDN1-тэй холбогдохыг ялгаатай зохицуулдаг болохыг харуулж байна.IFNα нь H2B ба HLA-A хоорондын холбоог өдөөдөг боловч MDN1-тэй холбоог бууруулдаг.Хяналтад MDN1 нь HLA-A-тай холбоотой болохыг бид олж мэдсэн бөгөөд IFNα-г нэмснээр IFNα-ийн MDN1-ийн индукцээс үл хамааран энэхүү харилцан үйлчлэлийг бууруулсан (Зураг 7B,C).
HLA-A нь H2B болон MDN1-ийг хамт цэвэршүүлдэг.Төлөөлөгч эндоген H2B (A) ба MDN1 (B) иммуноблотуудыг IFNα-тай эмчилсэн Flo-1 эсээс дархлаажуулж, заасан эсрэгбиемүүдийг шалгасан.(C) Янз бүрийн эсрэгтөрөгчийн харьцангуй хэмжээг (оролт) заасан эсрэгбиемүүдийн эсрэг шалгасан иммуноблотоор дүрсэлсэн бөгөөд β-актиныг ачааллын хяналт болгон ашигласан.
Бид молекулын динамикийн загварчлалыг энэ цогцолборт оролцдог уургийн конформацийн динамикийг ойлгох өөр арга болгон ашигласан (Зураг 8).Тиймээс дараахь боломжит цогцолбор нь уусгагчаар бичсэн. H2b-hla-hla-hla-hla-a, and hla-hla-hla-hla-a-hmga1.MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) багцыг ашиглан анх удаа уураг-уураг залгах дэлгэц нь эдгээр уургуудын хооронд ялгаатай байж болох хэлбэрийг санал болгосон (Зураг 8А).Тиймээс нэг боломжит хэлбэрийг Зураг 8А-д (шошготой хөндлөн холбоостой) үзүүлсэн бөгөөд үүнийг MD загварчлалын шугам хоолойг ашиглан цаашид үнэлэв.
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, H2B-HLA-A-HMGA1 цогцолборуудын хоорондох боломжит сүлжээнүүдийн конформацийн динамик.(A) Зүүн талын самбар нь молекул доторх (улаан) ба молекул хоорондын (цэнхэр) хөндлөн холбоосуудын 2 хэмжээст газрын зураг (SIM-XL программ хангамжид бүтээгдсэн) юм (хөндлөн холбоосын таслалтыг 3.5 болгож тохируулсан).Зүүн доод самбарт уураг-уурагтай холбох янз бүрийн хамаарал бүхий (GBVI/WSA dG; ккал/моль) H2B-HLA-A ба HMGA1-HLA-A цогцолборуудын янз бүрийн боломжит хэлбэрийг харуулав.(B) Уургийн бүтэц тус бүрийн атомын байрлалын (устөрөгчийн атомаас бусад) стандарт хазайлт (RMSD).H-BOD BONDON-ийн ХУДАЛДААНЫ ХУДАЛДААНЫ ХУДАЛДААНЫ ХЯНАЛТЫН ХУДАЛДАН АВАХ 3.5 Å, Донор-Хүлээн авах, Донор-Хүлээн авагчийн тайралтыг indover-heveroff Tode гэж тохируулсан.(D) Хуурамч HLA-A-H2B болон HLA-A-HMGA1 цогцолбороос гаргаж авсан ≥ 20 ns-ийн хүрээтэй HLA-A уураг-уургийн харилцан үйлчлэлийг үүсгэгч хаяглагдсан үлдэгдэл.Уураг бүтэц нь 100 ns mds-ийн дундаж бүтцийг илэрхийлдэг.(E) HLA-A-H2B болон HLA-A-HMGA1 цогцолборуудын хоорондын харилцан үйлчлэлийг хоёр пептидийн хоорондох K эсвэл S харилцан үйлчлэлийн талбайд үндэслэн 100 ns-ээс дээш H2B-HLA загварчлалаар хянасан харилцан үйлчлэлтэй харьцуулсан.Цогцолборууд /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Хөндлөн холбоосыг үнэлэх босго утгыг 3.0 гэж тохируулсан бөгөөд MDS-ийн ≥ 10 ns-ийн харилцан үйлчлэлийг харгалзан үзсэн.Уургийн бүтцийг BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) болон Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) багцуудыг ашиглан дүрсэлсэн.
Цаг хугацааны туршид HLA-A молекулуудын тогтвортой байдал (стандарт хазайлт; RMSD эсвэл стандарт хазайлт; RMSF) нь цогцолборуудад H2B эсвэл HMGA1 уураг байгаа нь HLA-A-г тогтворжуулж байгааг харуулж байна (Зураг 8B, Зураг S5).HMGA1 уураг нь HLA-A-ийн B2M сайттай нягт холбогдож, HLA-A-HMGA1 эсвэл H2B-HLA-A-HMGA1 цогцолбор дахь HLA-A амин хүчлүүдийн тогтвортой байдлыг өдөөдөг (Зураг 8B, Зураг S5).Устөрөгчийн холбоонд оролцдог үлдэгдэл (MD загвараар өндөр эзэлдэг ≥ 10 ns) нь цогцолбор дахь CLMS-ийн харилцан үйлчлэлийн газруудтай (K эсвэл S үлдэгдэл) давхцаж байгаа нь CLMS-ээр тодорхойлсон харилцан үйлчлэл нь маш найдвартай болохыг харуулж байна.Найдвартай байдал (Зураг 8E).
Уураг-уургийн харилцан үйлчлэл нь тодорхой өдөөлтөд хариу үйлдэл үзүүлэхэд эсийн доторх харилцааг зуучлах динамик бүтцийн сүлжээг үүсгэдэг.Протеомикийн олон аргууд нь уургийн ерөнхий тогтвортой байдлын түвшний өөрчлөлтийг илрүүлдэг тул уураг-уургийн харилцан үйлчлэлийн динамик нь холбох интерфейсийг олж авах нэмэлт хэрэгсэл шаарддаг бөгөөд CLMS нь ийм хэрэгсэл юм.Интерфероны дохиоллын систем нь цитокины сүлжээ бөгөөд эсүүд хүрээлэн буй орчны эмгэг төрүүлэгч болон дотоод эмгэгийн дохиололд хариу үйлдэл үзүүлэх боломжийг олгодог бөгөөд интерфероноор өдөөгддөг уургийн дэд бүлгүүдийг үүсгэдэг.Хөндлөн холбоогүй ба хөндлөн холбоос бүхий эсүүдээс триптик пептидүүдийг гаргаж авснаар пептидийг тоолох, замыг баяжуулах, тодорхой LFQ эрчимтэй пептидийн уртыг хуваарилах боломжийг олгодог.Төрөл бүрийн бүтцийн онцлог, функциональ хэсгүүдийн харилцан үйлчлэлийг судалсан.
HLA-A, MDN1 ба H2B-ийн хоорондын харилцан үйлчлэлийг IFNα-тай эмчилсэн болон эмчлээгүй Flo-1 болон A549 эсүүдэд иммуноблотын аргаар илрүүлсэн.Мөн эсийн төрлөөс хамааралгүй интерфероноор дамждаг уургийн харилцан үйлчлэлийг тодорхойлохын тулд CLMS аргыг эсийн шугамын самбарт өргөжүүлэх нь сонирхолтой байх болно.Эцэст нь бид MD загварчлалыг H2BFS-HLA-A-HMGA1 цогцолборт оролцдог уургийн конформацийн динамикийг ойлгох өөр арга болгон ашигласан бөгөөд энэ нь молекул доторх ба молекул хоорондын харилцан яриаг хянадаг.Манай аргын гол давуу талуудын нэг нь HLA зэрэг харилцан үйлчлэлцдэг полиморф генийг хялбархан тодорхойлох боломжийг олгодог тул судлахад хэцүү HLA гаплотипийн өвөрмөц уургийн харилцан үйлчлэлийг судлах нь сонирхолтой байх болно.Хамтдаа авч үзвэл, CLMS нь интерфероноор өдөөгдсөн дохионы сүлжээний талаарх бидний ойлголтыг өргөжүүлэхэд ашиглагдаж, хавдрын бичил орчинд илүү нарийн төвөгтэй эс хоорондын системийг судлах үндэс суурь болж байгааг харуулж байна.
Flo-1 эсийг ATCC-ээс гаргаж аваад DMEM (Gibco) -д 1% пенициллин/стрептомицин (Инвитроген), 10% ургийн үхрийн ийлдэс (Гибко) нэмж, 37°С, 5% CO2-т хадгалсан.Инкубаци.Бусад бүх химийн бодис, урвалжуудыг өөрөөр заагаагүй бол Sigma Aldrich-ээс худалдаж авсан.
Flo-1 эсийг 6 цооногийн ялтсуудад өсгөвөрлөж, дараагийн өдөр нь 10 нг/мл IFNα14-ээр 24 цагийн турш ойролцоогоор 80% нийлсэн эсийг эмчилсэн.DSS Crosslinking-ийн урвалыг PBS болон үлдэгдэл DS-ээр сольж байсан PBS (PH 8.0) -ийг PBS (PH 8.0) -ийг 37 ° C нэмж оруулав.Эсийг хусах замаар цуглуулж, бага холбогч хоолойд (Axygen) цуглуулсан.
Центрифугийн бүх үе шатыг 14,000 xg температурт 8 ° C-д гүйцэтгэсэн.Үлдсэн тунгалаг хэсгүүдийг 150 мкл хоёр дахь задралын буфер (2 М мочевин, 2% (х/х) SDS (натрийн додецил сульфат)) нэг төрлийн усан уусмал авах хүртэл 30 минут ба түүнээс дээш хугацаанд уусгана.Уургийн концентрацийг микроплитийн процедурын үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу Micro BCA шинжилгээ (Thermo Fisher Scientific) ашиглан үнэлэв.Дээжийг шингэн азотоор түргэн хөлдөөж, -80 хэмд хадгалсан.
Wisniewski нар тайлбарласны дагуу 100 мкг орчим уусдаг хөндлөн холбоост уургийг өөрчилсөн шүүлтүүрийн дээж бэлтгэх протокол (FASP) ашиглан боловсруулсан.Хөндлөн холбоост уургийн лизатын эхний хагасыг Ultracel-10 мембран (Merck) суурилуулсан 10 кДа хүчин чадалтай Микрокон төвөөс зугтах шүүлтүүр төхөөрөмжид шилжүүлж, дараа нь шүүлтүүр дээр 25 минутын турш центрифуг хийсэн.Дараа нь уургийн хоёр дахь хагасыг шүүлтүүрт нэмээд ижил алхмуудыг давтана.Мочевин буферт 100 мкл 17 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфины гидрохлорид (TCEP) нэмснээр уургийн нөхөн сэргээлтийг гүйцэтгэсэн.Алкилизацийн урвалыг тасалгааны температурт 20 минутын турш харанхуйд явуулав.Баганыг эргүүлж, баганын ханыг 100 мкл мочевин буферээр 3 удаа угааж, дараа нь центрифуг хийнэ.Ижил үйлдлийг 100 мкл 100 мм аммонийн бикарбонат ашиглан 3 удаа хийсэн.Трипсин хийхээс өмнө цуглуулах хоолойг шинээр солих хэрэгтэй.50 мМ аммонийн бикарбонат, трипсин буфер (Промега) -д шингэлсэн 1 мкл трипсин агуулсан хоол боловсруулах буфер нэмнэ.Трипсин ба уургийн харьцааг ойролцоогоор 1:33 хэмд байлгаж, хоол боловсруулах урвалыг чийгтэй өрөөнд 37 ° C-т шөнийн турш өсгөвөрлөнө.Crosslinked Peptide-ийг шүүлтүүрээс 25 минутын турш шүүлтүүрээс гаргаж авсан.Шүүлтүүрт 50 мкл 0.5 М NaCl нэмээд 25 минутын турш центрифуг хийснээр пептидийн нөхөн сэргэлт сайжирсан.
C18 Micro Spin багануудыг (Харвардын аппарат) Bouchal et al.70-ийн тодорхойлсон протоколын дагуу бага зэргийн өөрчлөлттэй холбосон триптик пептидүүдийг давсгүйжүүлэхэд ашигласан.Цэвэрлэсэн пептидүүдийг 100 мкл 0.08% трифтор цууны хүчилд 2.5% AcN-д уусгаж, концентрацийг NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) дээр хэмжсэн.
Орбитрап Exploris 480 масс спектрометрт (Thermo Scientific) холбогдсон UltiMate 3000 RSLCnano LC систем (Thermo Scientific) дээр хөндлөн холбоос бүхий пептидүүдийг салгасан.C18 PepMap100 сорбент болон 5 микрон PepMap сорбент (Thermo Scientific) бүхий 300 μм ID, 5 мм урт μ-баганаас өмнөх C18 барих баганад хөндлөн холбоос бүхий пептидүүдийг цуглуулсан.2.5% AcN-д ууссан 0.08% трифтор цууны хүчил 5 мкл/мин хурдтай насосны урсгалыг ачаална.Хөндлөн холбоос бүхий пептидүүдийг аналитик хайлуулсан цахиурын багананд салгаж, дотоод диаметр нь 75 мкм, урт нь 150 мм-ийн урттай, 2 мкм PepMap сорбент (Thermo Scientific) дүүргэсэн.А ба В хөдөлгөөнт фазууд нь усанд 0.1%, ацетонитрилд 0.1% FA-аас бүрддэг.Градиент нь 2.5% B-ээс эхэлж, 90 минутын турш 40% B, дараа нь дараагийн 2 минутын дотор 90% B хүртэл шугаман байдлаар нэмэгддэг.Хөдөлгөөнт фазын найрлагыг 10 минутын турш 90% В-д байлгаж, дараа нь 2 минутын турш 2.5% B хүртэл шугаман бууруулсан.Багана дараагийн мөчлөгт 8 минутын өмнө 8 минутын өмнө тэнцсэн байв.Аналитик баганаас ялгарсан хөндлөн холбоос бүхий пептидүүдийг наноэлектроспрай иончлолын (NSI) эх үүсвэрт ионжуулж, Exploris 480 масс спектрометрт (Thermo Scientific) тарьсан.
Orbitrap Exploris 480 масс спектрометр нь эерэг өгөгдлийн корреляцийн горимд ажилласан.Хэвийн болгосон AGC зорилтыг 300%, хамгийн их оролтын хугацаа 50 мс-ээр тогтоосон.Monoisotopic оргилыг илрүүлэлт нь пептидэд байгуулагдсан.Прекурсорын хамгийн бага ионы хүчийг 5.0e3 гэж тохируулсан бөгөөд +8 хүртэлх прекурсорын цэнэгийн төлөвийг туршилтанд оруулсан.
Мэдээллийн корреляцийн горим дахь томоохон сканноны хоорондох мөчлөгийн хугацаа 2.5 секундэд тохируулсан.Динамик массын хасалтыг урьдчилж таамаглах ионы эхний хэсгүүдийн дараа 20 секундын дараа хийгдсэн.Мөргөлдөөний энергийг 30% болгож тохируулсан.Orbitrap-ийн нарийвчлалыг 15,000, AGC зорилтыг 100% гэж тогтоосон.
Хөндлөн холбоостой дээж дэх уураг-уургийн сүлжээг хянахын өмнө бид дээж дэх ул мөр болох пептид/уургийг тодорхойлохын тулд MaxQuant багц (хувилбар 1.6.12.0)26,27 ашиглан түүхий файлуудыг боловсруулсан.Нэмж дурдахад ижил төстэй протеомик шинжилгээг IFNα-тай эмчилсэн болон боловсруулаагүй, хөндлөн холбоогүй Flo-1 дээж дээр хийсэн.MS/MS-ийн өгөгдлийг UniProt хүний ​​мэдээллийн сангаас (www.uniprot.org) хайсан (2020 оны 8-р сарын 12-нд байршуулсан, 75,093 бичлэг агуулсан) Andromeda27 суурилагдсан хайлтын системийг ашиглан.Ферментийн өвөрмөц байдал, деамидаци (N, Q) ба исэлдэлтийн (M) янз бүрийн өөрчлөлтийг заагаагүй хайлт хийсэн.Прекурсорын массын хүлцлийг 20 ppm, бүтээгдэхүүний ионыг 0.02 Да-д тохируулсан.Эхний болон хамгийн их массын хазайлтыг 10 цаг хүртэл тогтоосон.Пептидийн хамгийн их массыг 4600 Да, дарааллын ижил төстэй байдлыг 7-25 амин хүчлийн (aa) хооронд тогтоосон.Цаашдын статистик шинжилгээг Perseus программ (хувилбар 1.6.10.45) ашиглан хийсэн.Уургийн агууламжийг уургийн спектрийн эрчмийг (LFQ эрчмийг; шошгогүй тоон үзүүлэлт) 27 хэвийн болгох замаар тооцоолж, эрчмийн утгыг Log2 болгон хөрвүүлэв.R (v 4.1.2) дахь pheatmap (v1.0.12) багцыг ашиглан пептидийн эрч хүчээр тодорхойлогдсон уургийн шаталсан кластерийг бүтээсэн.Эмчилгээ хийгээгүй дээжтэй харьцуулахад 4 дахин их идэвхжсэн IFNα-аар эмчилсэн уургийн Reactome замын мэдээллийн санг ашиглан замын баяжуулалтын шинжилгээг хийсэн.
LC-MS/MS-ээр хянагдсан уургийн цогцолборуудын лизин (K) эсвэл серин (S) өвөрмөц химийн хөндлөн холбоосыг тодорхойлохдоо хөндлөн холбоост пептид (SIM-XL) 29-ийн спектроскопийн таних машин (SIM-XL) ашиглан гүйцэтгэсэн.Бүх хүний ​​UniProt-ийн бүх нөхцөл байдал, давталтыг шалгах нь тооцооллын хувьд эрчимтэй байдаг тул хүний ​​UniProt мэдээллийн сан (www.uniprot.org) бүхэлдээ (2020 оны 8-р сарын 12-нд татаж авсан, 75,093 оруулгуудыг агуулж байна) IFNα-тай харьцсан давталтын эсрэг.Өндөр итгэлцлийн харилцан үйлчлэлийн шүүлтүүрүүдийн нэг.Эдгээр өндөр ач холбогдолтой харилцан үйлчлэлийг өргөжүүлж, бүх давталт, нөхцөл байдалд туршиж үзсэн.
SIM-XL-д DSS-ийг хөндлөн холбогч (XL)-д ашигласан бөгөөд XL жингийн шилжилт ба өөрчлөлтийн жингийн шилжилтийг тус тус 138.06 ба 156.07 гэж тохируулсан.Дараах хөндлөн холбоосын урвалын цэгүүдийг авч үзнэ: KK, KS ба KN-TERM, сурвалжлагч ионгүй.Прекурсор болон фрагментийн ppm-ийг хоёуланг нь 20 болгож, Xrea-ийн босгыг 0.15 болгож тохируулсан.Трипсиныг бүрэн өвөрмөц гэж үзсэн бөгөөд өндөр энергитэй C-trap (HCD) хуваагдах аргыг хэрэгжүүлсэн.XCorr динамик DB бууруулах босго болон динамик DB бууруулах пептидийн хамгийн бага тоог 2.5 ба 2 гэж тохируулсан.Бусад үзүүлэлтүүд нь: моноизотопын магадлал ба оргил давхцлын хязгаар, хэлхээ бүрт хамгийн багадаа 4 АА үлдэгдэл ба хамгийн их хэлхээний цэнэг, алдагдсан хуваагдлын 3 максимум байна.Үр дүнд нь оёсон 2D газрын зургийг (SIM-XL) шинжилж, xQuest28 график дүрслэлийг 2D газрын зургийг бүтээхэд ашигласан.Уургийн бүтэц дээрх уургийн хөндлөн холбоосыг PyMol (PyMOL молекул графикийн систем, хувилбар 2.0 Schrödinger, LLC)-д өгсөн болно.
Phyre2 нь мэдэгдэж буй уургийн бүтэцтэй дарааллаар нийцүүлэн загвар бүтцийг үүсгэдэг.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, MDN1 уургуудын хувьд 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, 6i2665 загвар бүтцийг ашигласан.Үүнээс гадна AlphaFold71 MX1, UBP18, ROBO1-ийн бүтцийг мөн авч үзсэн.Уургийн бүтцийг BIOVIA Discovery Studio Visualizer багц (Dassault Systèmes, BIOVIA, Сан Диего, АНУ) болон Молекулын үйл ажиллагааны орчны багц (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канад) ашиглан дүрсэлсэн.