ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Химийн үйлдвэрийн химийн бүрэлдэхүүнд зориулсан хоёр талт гагнасан хоолой, SPECC1L-ийн дутагдал нь залгагдсан үений тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлж, гавлын мэдрэлийн эсүүдийн урсалтыг бууруулдаг.

Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Химийн үйлдвэрт зориулсан хоёр талт гагнасан хоолой

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.нь зэвэрдэггүй ган оёдолгүй хоолой, тод ангалсан хоолой, оёдолгүй ороомог хоолой гэх мэт чиглэлээр мэргэшсэн тэргүүлэгч үйлдвэрлэгч юм.Үйлчлүүлэгчдийг хөнгөвчлөхийн тулд бид гагнасан хоолой, хоолойтой.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.хамгийн дэвшилтэт үйлдвэрлэлийн болон туршилтын тоног төхөөрөмжтэй.Бид таны шаардлагыг бүрэн хангаж чадна.Стандартын дагуу бидний үйлдвэрлэсэн хоолойнууд үргэлж OD болон WT хүлцэлтэй байдаг.Хүлцлийн хяналт нь үйлдвэрлэлийн стандартын дагуу хатуу байдаг.Манай бүтээгдэхүүн үргэлж үйлчлүүлэгчдийн сэтгэл ханамжтай байдаг.Үйлчлүүлэгчид манай бүтээгдэхүүнийг худалдан авсан нь илүү их ашиг авчирсан.
a) OD (Гадна диаметр): 3.18мм-ээс 101.6мм
b) WT (ханын зузаан): 0.5мм-ээс 20мм
в) Урт: Хэрэглэгчийн шаардлагын дагуу
d) Стандартууд: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 гэх мэт
e) Процессын арга: ERW, EFW гэх мэт

Слайд бүрт гурван өгүүллийг харуулсан слайдерууд.Слайдуудын дундуур шилжихийн тулд буцах болон дараагийн товчлууруудыг, слайд бүрээр шилжихийн тулд төгсгөлд байрлах слайд хянагчийн товчлууруудыг ашиглана уу.
Гавлын мэдрэлийн эсүүд (CNCC) үр хөврөлийн мэдрэлийн нугалаасыг салгаж, дунд нүүрний ихэнх бүтцийг бүрдүүлдэг залгиурын нуман руу шилждэг.CNCC-ийн үйл ажиллагааны доголдол нь нийтлэг төрөлхийн гажиг болох амны хөндийн хагарал үүсэхэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.Гетерозигот SPECC1L мутаци нь атипийн болон хам шинжийн ан цав бүхий өвчтөнүүдэд илэрсэн.Энд бид каноник наалдамхай уулзвар (AJ) бүрэлдэхүүн хэсгүүд, β-катенин ба Е-кадхериныг өсгөвөрлөсөн SPECC1L устгалын эсүүдэд сайжруулсан будгийг мэдээлсэн бөгөөд электрон микрографи нь AJ-ийн оройн суурь тархалтыг харуулж байна.Гавал нүүрний морфогенезид SPECC1L-ийн үүргийг ойлгохын тулд бид Specc1l дутагдалтай хулганы загварыг бүтээсэн.Гомозигот мутантууд нь үр хөврөлийг үхэлд хүргэдэг бөгөөд мэдрэлийн хоолойн битүүмжлэл, CNCC ламинатыг харуулдаг.Мутантын мэдрэлийн нугалахад AJ уургийн будалт нэмэгддэг.Энэхүү AJ-ийн согог нь CNCC-ийн давхаргын согогтой нийцэж байгаа бөгөөд AJ татан буулгах шаардлагатай.Үүнээс гадна Specc11 мутантууд PI3K-AKT дохиог бууруулж, апоптозыг нэмэгдүүлсэн.In vitro, зэрлэг төрлийн эсүүдэд PI3K-AKT дохиололыг бага зэрэг дарангуйлах нь AJ өөрчлөлтийг өдөөхөд хангалттай байв.Хамгийн чухал нь SPECC1L-ийн уналтаас үүдэлтэй AJ өөрчлөлтийг PI3K-AKT замыг идэвхжүүлснээр буцаах боломжтой.Эдгээр өгөгдлүүдийг нэгтгэн үзвэл SPECC1L нь PI3K-AKT дохиолол ба AJ биологийн шинэ зохицуулагчийн хувьд мэдрэлийн гуурсыг хаах, CNCC давхаргажилтад шаардлагатай болохыг харуулж байна.
Гавлын мэдрэлийн эсүүд (CNCCs) нь нурууны нейроэктодерм дээр нутагшиж, хучуур эд-мезенхимийн шилжилт (EMT)-тай холбоотой процессоор хөгжиж буй мэдрэлийн нугаламаас мэдрэлийн эпителиээс салдаг.Урьдчилан нүүж буй хучуур эдийн CNCC нь эс хоорондын уулзваруудыг тасалдуулж, нүүдлийн мезенхимийн CNCC болж, эхний болон хоёрдугаар залгиурын нумануудыг дүүргэж, гавлын нүүрний мөгөөрсний ихэнх хэсгийг бүрдүүлдэг.Тиймээс CNCC-ийн үйл ажиллагааг зохицуулдаг генүүд нь амны хөндийн ан цав зэрэг гавлын нүүрний төрөлхийн гажиг үүсэхэд ихэвчлэн тасалддаг бөгөөд зөвхөн АНУ-д 1/800 төрөлтөд нөлөөлдөг.Төрөлхийн гажигуудын нэг8.
CNCC-ийн деламинаци нь хулганын үр хөврөлийн хөгжлийн 8.5-аас 9.5 хоногийн хооронд урд талын мэдрэлийн хоолой хаагдахтай давхцдаг.Хулганы амны хөндийн цоорхойтой холбоотой хэд хэдэн генийн мутантууд нь Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, Pdgfrα12 зэрэг мэдрэлийн хоолойн гажигтай байдаг.Гэсэн хэдий ч, мэдрэлийн хоолой хаагдах болон CNCC давхаргажилтын үйл явцыг бие даасан гэж үзэж болно, учир нь Splotch мутант хулгана (Pax3) нь CNCC давхаргажилт эсвэл шилжилт хөдөлгөөнд ямар ч нөлөө үзүүлэхгүйгээр мэдрэлийн хоолойн хаалтын согогийг харуулдаг 13,14.CNCC задлах, мэдрэлийн хоолойг хаах зэрэг согогтой хулганы нэмэлт загварууд нь эдгээр хоёр үйл явцын нийтлэг молекулын үндсийг тодорхойлоход тусална.
Нейроэпителийн эсүүдээс CNCC-ийг тусгаарлахын тулд актин утастай холбоотой E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, α-актинин агуулсан уургийн цогцолбороос бүрдэх наалдамхай холбоосыг (AJs) татан буулгах шаардлагатай. Мэдрэлийн атираа дахь E-cadherin-ийн хэт илэрхийллийн судалгаа нь CNCC-ийн давхаргыг бууруулах эсвэл удаашруулж байгааг харуулсан.Эсрэгээр, E-cadherin-ийг дарах нь эрт үе давхаргад хүргэдэг15,16.CNCC-ийн давхаргажилтын үед EMT-ийг зуучилдаг олон хүчин зүйл нь транскрипцийн хүчин зүйлүүд (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ба эсийн гаднах матрицыг (ECM) дахин загварчлах уургууд, тухайлбал матрицын металлопротеиназа (MMPs) боловч CNCC нь шууд эсийн араг яс юм. хараахан мэдэгдээгүй байна.PI3K-AKT зам нь E-cadherin-ийн түвшинг эсэргүүцдэг нь голчлон хорт хавдрын судалгаагаар тодорхойлогддог17.Сүүлийн үеийн судалгаагаар хулганад PDGFα-д суурилсан PI3K-AKT дохио алдагдах нь гавлын нүүрний гажиг, түүний дотор тагнайн сэтэрхий, мэдрэлийн хоолойн согог зэрэгт хүргэдэг болохыг харуулсан.Гэсэн хэдий ч PI3K-AKT зам ба CNCC давхаргажилтын AJ тогтвортой байдлын хоорондын хамаарал тодорхойгүй байна.
Бид өмнө нь SPECC1L-ийг ташуу ан цав (ObFC) эсвэл Tessier IV18 ан цав гэж нэрлэгддэг амнаас нүд хүртэл үргэлжилсэн хүнд хэлбэрийн ан цавтай хоёр хүний ​​анхны мутант ген болохыг тодорхойлсон.SPECC1L мутаци нь аутосомын давамгайлсан Opitz G/BBB хам шинж (OMIM #145410) бүхий олон үеийн хоёр гэр бүлд илэрсэн бөгөөд үүнд өртсөн хүмүүс хэт алсын зай, уруул/ тагнай сэтэрхий19, мөн Тиби хэт холын хам шинжтэй нэг гэр бүлд (OMIM #145420)20 илэрсэн. .Opitz G/BBB хам шинжийн тохиолдлын талаас илүү хувь нь X-холбогдсон (OMIM #300000) бөгөөд микротубултай холбоотой эсийн араг ясны 22-р уургийг кодлодог MID1 генийн мутациас үүдэлтэй.Бидний таамаглаж буйгаар SPECC1L, мөн бичил гуурсан хоолой ба актин эсийн араг ястай холбоотой уураг нь эсийн наалдац, шилжилт хөдөлгөөний үед актины цитоскелетоныг өөрчлөхөд шаардлагатай дохиололд зуучлагч байж болно 18.In vitro болон in vivo судалгаагаар бид одоо SPECC1L-ийг PI3K-AKT дохиогоор дамжуулан AJ тогтвортой байдлын шинэ зохицуулагч гэж тодорхойлсон.Эсийн түвшинд SPECC1L-ийн дутагдал нь pan-AKT уургийн түвшин буурч, AJ-ийн оройн-суурь дисперсийг ихэсгэж, AKT замын химийн идэвхжлээр арилдаг.In vivo, Specc11-ийн дутагдалтай үр хөврөлд мэдрэлийн хоолойн хаалт буурч, CNCC задрал багассан байна.Тиймээс SPECC1L нь нүүрний морфогенезийн үед CNCC-ийн хэвийн үйл ажиллагаанд шаардлагатай өндөр зохицуулалттай эсийн наалдац дээр суурилсан дохиололд ажилладаг.
Эсийн түвшинд SPECC1L-ийн үүргийг тодорхойлохын тулд бид SPECC1L18-ийн дутагдалтай урьд өмнө тайлбарласан тогтвортой остеосаркомын U2OS эсийн шугамыг ашигласан.SPECC1L (kd) уналттай эдгээр тогтвортой U2OS эсүүдэд SPECC1L транскрипт болон уургийн түвшин дунд зэргийн (60-70%) буурч, актин цитоскелетоны шилжилт хөдөлгөөн, өөрчлөн байгуулалтын гажигтай 18. Харин эсрэгээр нь түр зуурын огцом буурсан SPECC1L нь митозын гажиг үүсгэдэг болохыг харуулсан 23 .Цаашдын шинж чанарыг тодорхойлоход бидний тогтвортой SPECC1L-kd эсүүд маш өндөр нийлбэрийн үед морфологи өөрчлөгдсөн болохыг олж мэдсэн (Зураг 1).Бие даасан хяналтын эсүүд болон бага уулзвар дахь kd эсүүд ижил төстэй харагдаж байна (Зураг 1A,D).Ууссанаас хойш 24 цагийн дараа хяналтын эсүүд куб хэлбэртэй (Зураг 1B, E), харин SPECC1L-kd эсүүд уртассан (Зураг 1C, F) хэвээр үлджээ.Энэхүү эсийн хэлбэрийн өөрчлөлтийн цар хүрээг хяналтын эсүүд болон kd эсийн амьд дүрслэл (кино 1) авсан.Нийлсэн эсэд SPECC1L-ийн үүргийг тодорхойлохын тулд бид эхлээд түүний илэрхийлэлийг шалгасан.Бид хайлсны дараа SPECC1L уургийн түвшин нэмэгдсэнийг олж мэдсэн (Зураг 1G), харин SPECC1L транскриптийн түвшин нэмэгдээгүй (Зураг 1H).Нэмж дурдахад эсийн нягтрал нэмэгдэхийн хэрээр SPECC1L уураг нь эс хоорондын хил хязгаарт (Зураг 2A-E) хуримтлагдаж, мембрантай холбоотой β-катенин (Зураг 2A'-E')-тай давхцаж байна.SPECC1L нь актин эсийн араг ястай 18,23 холбоотой байгааг харгалзан бид SPECC1L нь актин дээр суурилсан наалдамхай холболттой (AJ) харилцан үйлчилдэг гэсэн таамаглал дэвшүүлсэн.
(AF) SPECC1L унадаг (DF) эсүүд нь хяналтын U2OS эсүүдтэй (AC) харьцуулахад өндөр нийлбэр (F) дээр уртасдаг.Бидний өөр өөр эсийн нягтралаар сонгосон зургаан цаг хугацааны гурвыг (T1, T3, T6) энд харуулав.(G) Western blot шинжилгээ нь SPECC1L уураг нь хяналтын эсүүд дэх бага нийлбэртэй харьцуулахад өндөр нийлбэрт тогтворжсон болохыг харуулж байна.SPECC1L-ийн баруун толбо нь хүлээгдэж буй 120 кДа зурвас ба илүү өндөр молекул жинтэй зурвасыг харуулж байна, магадгүй орчуулгын дараа өөрчлөгдсөн (*).Western blot шинжилгээг ижил нөхцөлд бага ба өндөр нийлбэрт хийсэн.SPECC1L-ийг бага ба өндөр нийлбэрт харуулсан зургуудыг ижил толбоноос авсан.Ижил толбыг арилгаж, β-актины эсрэгбиемээр дахин шалгасан.(H) RT-ПГУ-ын тоон шинжилгээгээр SPECC1L транскриптийн түвшинд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гараагүй байна.Алдааны мөр нь бие даасан дөрвөн туршилтын SEM-ийг төлөөлдөг.
(AE) Бид SPECC1L-ийг буулгах (kd) бүхий U2OS эсүүд дэх эсийн хэлбэрийн шинжилгээ болон AJ өөрчлөлтийг хэвийн болгохын тулд эсийн нягтралын хүрээг төлөөлөх зургаан цагийн цэгийг (T1-T6) сонгосон.Эдгээр цаг хугацааны эхний тавд нэг эс (T1), жижиг эсийн бөөгнөрөлүүдийн 50-70%-ийн нэгдэл (T2), kd эсийн хэлбэрийг өөрчлөхгүйгээр нэгдэх (T3), kd эсийн хэлбэрийг өөрчлөх (T4) болон 24 цагийн өөрчлөлт орсон.kd (T5) эсийн арын хэлбэрт.SPECC1L уураг нь T1 (A) дээр цитоплазмд голчлон тархсан боловч дараагийн цаг хугацааны цэгүүдэд (B-E, сум) түүний хуримтлал нь эс хоорондын хил хязгаарт ажиглагдсан.(FJ) β-катенин нь AJ цогцолбортой холбоотой эс хоорондын хил дээр ижил төстэй хуримтлалыг харуулдаг.(A'-E') SPECC1L ба β-катенин нь эсийн өндөр нягтралтай үед эсийн хил дээр давхардсан будгийг харуулж байна (сум).(F'-J') SPECC1L-kd эсүүдэд β-катенины будалт нь эсийн нягтрал багатай үед (F'-H') хэвийн харагддаг боловч эсийн хэлбэр өөрчлөгдөхөд (I', J'; сумнууд) өргөжиж, AJ байгааг харуулж байна. өөрчлөгдсөн.Баар = 10 мкм.
Дараа нь бид SPECC1L-ийн дутагдлын AJ-д үзүүлэх нөлөөг тодорхойлохыг оролдсон.Бид F-actin, myosin IIb, β-catenin, E-cadherin24,25,26,27 зэрэг каноник бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг багтаасан AJ-тэй холбоотой хэд хэдэн тэмдэглэгээг ашигласан.Өмнө дурьдсанчлан SPECC1L-kd эсүүдэд актин стрессийн утас нэмэгдсэн (Зураг 3A,B) 18 .Актин судалтай холбоотой миозин IIb нь in vitro SPECC1L-kd эсийн ижил төстэй өсөлтийг харуулсан (Зураг 3C, D).AJ-тэй холбоотой β-катенин нь эсийн мембран дахь кадеринтэй холбогдож, хяналтын кубоцитын хэвийн "зөгийн сархинаг" илэрхийллийн загварыг харуулдаг (Зураг 3E,G).Сонирхолтой нь, төвлөрсөн микроскоп ашиглан хавтгай зураг дээр нийлсэн SPECC1L-ийн дутагдалтай эсийн мембран дээр β-катенин (Зураг 3E,F) болон Е-кадерин (Зураг 3G,H) будсан нь уртасгасан будгийн тод хэв маягийг харуулсан.kd эсүүд дэх AJ-тэй холбоотой β-катенины будгийн энэхүү тэлэлт нь нийлсэн үед хамгийн тод илэрдэг боловч эсийн хэлбэр өөрчлөгдөхөөс өмнө харагдаж байв (Зураг 2F-J, F'-J').Энэхүү өргөтгөсөн AJ будгийн физик шинж чанарыг тодорхойлохын тулд бид SPECC1L-kd U2OS эсийн оройн суурь гадаргуу дээрх эсийн хилийг дамжуулагч электрон микроскопоор (TEM) шалгасан (Зураг 3I,J).AJ (сум)-ыг заадаг тусдаа электрон нягт бүсүүдтэй хяналтын эсүүдээс (Зураг 3I) ялгаатай нь kd эсүүд (Зураг 3J) апикобазын хавтгайн дагуу AJ-ийг илтгэх электроны өндөр нягттай том, зэргэлдээ бүс нутгийг харуулсан..Нэмж дурдахад, хөндлөн огтлолууд дээр бид kd эсүүдэд эсийн мембраны өргөн атираа ажиглагдсан (Зураг. S1A, B), энэ нь β-катенин ба Е-кадхерин будгийн туузны өргөтгөсөн загварыг тайлбарладаг (Зураг 3F, H).AJs дахь SPECC1L-ийн үүргийг дэмжихийн тулд β-катенин нь U2OS эсийн нийлсэн эсүүдийн лизатуудад SPECC1L-тэй хамт иммунопреципитаци хийсэн (Зураг 3K).TEM шинжилгээ нь AJ маркеруудын дархлаажуулалтыг сунгахын зэрэгцээ SPECC1L-ийн дутагдал нь AJ-ийн оройн суурь нягт ба дисперсийг нэмэгдүүлдэг гэсэн бидний таамаглалтай нийцэж байв.
(AH) Хайлсны дараах 48 цагийн дараа kd эсийн F-актины будалт нэмэгдсэн (T6; A, B).F-актинтай холбоотой миозин IIb-ийн өөрчлөгдсөн будалт (C, D).Хяналтын эсүүд (E, G) дахь β-катенин ба Е-кадхерин мембраны будгийн жигд хэлбэрийг SPECC1L-kd (F, H) эсүүдэд сайжруулсан.Баар = 10 мкм.(I–J) Оройн суурь эс хоорондын уулзварыг ажиглаж буй электрон микрографи.Хяналтын эсүүд нь наалдамхай уулзваруудыг (I, сум) харуулсан электрон нягттай бүсүүдийг харуулдаг.Үүний эсрэгээр, SPECC1L-kd эсийн оройн суурь уулзвар бүхэлдээ электрон нягт (J, сум) харагдаж байсан нь наалдамхай уулзваруудын нягтрал, тархалт нэмэгдсэнийг харуулж байна.(K) β-катенин нь U2OS эсийн нийлсэн лизатуудад SPECC1L-тэй хамт иммунопреципитацид орсон.Дөрвөн бие даасан туршилтын нэгийг төлөөлж буй нэг цэгээс авсан зураг.
Гавал нүүрний морфогенезид SPECC1L-ийн үүргийг ойлгохын тулд бид интрон 1 ба Specc1l транскриптийг дүрсэлсэн DTM096 ба RRH048 (BayGenomics, CA) гэсэн хоёр бие даасан ES урхи эсийн шугамыг ашиглан Specc1l дутагдалтай хулганы загварыг бүтээсэн (Зураг 115). .4А, зураг S2).Хуурамч векторын оруулгын геномын байршлыг бүхэлд нь геномын дарааллаар тодорхойлж, ПГУ-аар баталгаажуулсан (Зураг S2).Хоёр генийн урхины загварууд нь баригдах үед Specc11-lacZ сурвалжлагчдыг хүрээ дотор нэгтгэх боломжийг олгосон.Тиймээс X-gal будгаар тодорхойлсон lacZ илэрхийлэлийг Specc11 илэрхийллийн үзүүлэлт болгон ашигласан.Хоёр аллель хоёулаа ижил төстэй lacZ экспрессийн хэв маягийг харуулсан бөгөөд интрон 1 дэх DTM096 генийн урхи нь интрон 15 дахь RRH048-аас илүү хүчтэй илэрхийлэлийг харуулсан (зураг дээр харуулаагүй).Гэсэн хэдий ч Specc1l нь E8.5 дахь мэдрэлийн нугалаас (Зураг 4B), E9.5, E10.5 дахь мэдрэлийн хоолой, нүүрний үйл явц (Зураг 4C, D) болон хөгжиж буй мөчрүүдэд хүчтэй илэрхийлэгддэг. E10 дээр.5 ба нүд (Зураг 4D).E10.5 дахь залгиурын эхний нуман дахь SPECC1L илэрхийлэл нь CNCC-ийн удам угсаатай нийцсэн хучуур эд болон суурь мезенхимд18 байгааг бид өмнө нь мэдээлсэн.CNCC-д SPECC1L илэрхийллийг шалгахын тулд бид E8.5 мэдрэлийн нугалаа (Зураг 4E-J) болон E9.5 гавлын ясны хэсгүүдийг (Зураг 4K-) хийсэн.E8.5-д SPECC1L нь мэдрэлийн нугаламыг эрчимтэй будсан (Зураг 4E, H), үүнд NCC маркераар будсан эсүүд (Зураг 4G, J).E9.5-д SPECC1L (Зураг 4K, N) AP2A (Зураг 4L, M) эсвэл SOX10 (Зураг 4O, P) -тэй хамт будсан шилжин суурьшсан CNCC-ийг хүчтэй будсан.
(A) ES DTM096 (интрон 1) ба RRH048 (интрон 15) эсийн клонд төөрөгдүүлэх вектор оруулахыг харуулсан хулганы Specc11 генийн бүдүүвч дүрслэл.(BD) E8.5-аас E10.5 хүртэлх Specc1l илэрхийлэлийг илэрхийлсэн гетерозигот Specc1lDTM096 үр хөврөлийн lacZ будалт.NE = neuroectoderm, NF = мэдрэлийн нугалах, PA1 = залгиурын эхний нум.(EP) E8.5 (NF; EJ) мэдрэлийн нугалам болон E9.5 (KP) гавлын ясны хэсгүүдэд NCC AP2A ба SOX10 маркер бүхий SPECC1L дархлаа будалт.SPECC1L будалт нь AP2A (F, G; сумны толгой) болон SOX10 (I, J; сумны толгой) гэсэн шошготой эсийг оролцуулан E8.5 мэдрэлийн нугалаас (E, H; сумны толгой) өргөнөөр ажиглагдсан.E9.5-д SPECC1L нь AP2A (L, M; сумнууд) болон SOX10 (O, P; сумнууд) гэсэн шошготой шилжин суурьшсан CNCC-уудыг (K, N; сум) хүчтэй будсан.
Гетерозигот Specc1lDTM096/+ болон Specc1lRRH048/+ хулгануудын хооронд хөндлөн огтлолцол нь хоёр ген барих аллель нь нэгдмэл биш бөгөөд генийн урхины аллелийн нэгдэл гетерозигот ба үр хөврөлийн гомозигот нь үр хөврөлийг үхэлд хүргэдэг болохыг харуулж байна (Хүснэгт S1).Менделийн харьцаа нь төрөх үед гетерозиготуудын оршин тогтнох түвшин буурч байгааг харуулж байна (хүлээгдэж буй 1.34 эсрэг 2.0).Бид гетерозиготуудын дунд перинаталь нас баралт бага байгааг тэмдэглэж, зарим нь гавлын нүүрний гажигтай байсан (Зураг S3).Гэсэн хэдий ч эдгээр перинаталь гавлын нүүрний фенотипүүдийн нэвтрэлт бага байгаа нь тэдгээрийн эмгэг физиологийн үндсэн механизмыг судлахад хүндрэл учруулдаг.Тиймээс бид гомозигот Specc11 мутантуудын үр хөврөлийн үхлийн фенотип дээр анхаарлаа хандуулсан.
Ихэнх нэгдэл гетерозигот эсвэл гомозигот Specc1lDTM096/RRH048 мутант үр хөврөл E9.5-10.5-аас хойш хөгжөөгүй (Зураг 5A-D), мэдрэлийн хоолой урд талдаа хаагддаггүй (Зураг 5B, D), заримдаа ар талдаа хаагддаг (зураг 5B, D) ..Энэ гавлын мэдрэлийн хоолойн хаалтын согог нь DLX2 тэмдэглэгдсэн CNCC-ийн ихэнх хэсэг нь E10.5-д мэдрэлийн нугалахад үлдсэнтэй холбоотой байсан нь задралгүй байгааг харуулж байна (Зураг 5A'-D').CNCC-ийн нийт хэмжээ багассан эсэхийг тодорхойлохын тулд бид CNCC шугамуудыг GFP-тэй Wnt1-Cre болон ROSAmTmG бүхий генийн зангилаа шугаманд тэмдэглэв.Бид бүх үр хөврөлөөс ангилсан GFP+ NCC болон GFP- (RFP+) NCC бусыг дамжуулдаг.E9.5-д урсгалаар ангилагдсан GFP шошготой CNCC-ийн эзлэх хувь WT болон мутант үр хөврөлийн хооронд мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөөгүй (зураг дээр харуулаагүй) нь CNCC-ийн хэвийн үзүүлэлтийг харуулж байна.Тиймээс бид ил гарсан мэдрэлийн атираа дахь Wnt1-Cre болон DLX2-ийн үлдэгдэл толбо (Зураг 5B') нь SPECC1L-kd эсүүдэд ажиглагдсан шиг AJ эсийн нягтрал эсвэл тархалт ихэссэнтэй холбоотой CNCC давхаргын гэмтэлтэй холбоотой гэж бид таамагласан.Бид мэдрэлийн нугалахад CNCC байгаа эсэхийг баталгаажуулахын тулд NCC SOX10, AP2A, DLX2 тэмдэглэгээг ашигласан (Зураг 5E-R).E8.5-д бүх гурван NCC маркерын мэдрэлийн нугалан будалт WT (Зураг 5E, G, I) болон Specc1l мутант (Зураг 5F, H, J) хэсгүүдэд ажиглагдсан.E9.5-д NCC маркерууд WT хэсгүүдэд нүүж буй NCC-ийг будсан байхад (Зураг 5M, O, Q), Specc1l мутант үр хөврөлийн ил гарсан мэдрэлийн нугалахад NCC-ийн үлдэгдэл будалт ажиглагдсан (Зураг 5N, P, R).SOX10 болон DLX2 нь шилжин суурьшиж буй CNCC-ийг тэмдэглэдэг тул энэ үр дүн нь SPECC1L-ийн дутагдалтай CNCC-ууд шилжин суурьшсаны дараах үзүүлэлтэд хүрсэн боловч мэдрэлийн нугалаас шилжиж чадахгүй байгааг харуулж байна.
Specc11-ийн дутагдал нь мэдрэлийн гуурсыг хаах, гавлын мэдрэлийн эсүүд болон AJ-ийг задлахад хүргэдэг.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') гэсэн шошготой нүүдлийн гавлын мэдрэлийн эсүүд (CNCC) тээж буй үр хөврөл.Үүний эсрэгээр Specc11 мутант үр хөврөлд нээлттэй мэдрэлийн атираа (B), сумны үзүүрүүд болон шилжин ирээгүй CNCC (B', сумны үзүүр) харагдана.(C, D') E10.5 WT үр хөврөлийн (C, C') болон Specc1l (D, D') CNCC тэмдэглэгээ DLX2-ийн тод талбайн зураг (C, D') болон дархлаа будах (C', D').WT E10.5 үр хөврөлд DLX2-эерэг CNCC заламгай нумануудыг колоничлодог (C', сумнууд), харин мутантуудын хувьд мэдрэлийн задгай нугалаа (D', сумнууд) болон залгиурын эхний нумануудад (D', сум).) зарим будалттай (сумтай) CNCC-ийн нүүлгэн шилжүүлэлт муу байгааг илтгэнэ.ER) WT болон Specc1l мутант үр хөврөлийн E8.5 (E–L) ба E9.5 (M–R) үе шатуудын хэсгүүдэд NCC маркерууд SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) болон DLX2 (I, J, Q, R).E8.5-д Зэрлэг хэлбэрийн мэдрэлийн нугалам (NF) болон мутант хэсгүүдэд NCC-ийн будалт ажиглагдсан.E8.5 WT (K) болон мутант (L) дахь SOX10 ба β-катенины хамт будах нь мэдрэлийн нугалам дахь эсийн хил дээр β-катенины будалт ихэссэнийг илрүүлсэн.E9.5-д шилжин суурьшсан CNCC-ийн (M, O, Q) зэрлэг төрлийн будалт ажиглагдсан бол мутантуудын хувьд давхаргагүй CNCCs нь мэдрэлийн задгай нугалаа (N, P, R) будсан байна.(S–Z) E9.5 мутацитай WT ба Specc11DTM096/RRH048 үр хөврөлийн титэм хэсгүүдийн in vivo AJ шошгоны шинжилгээ.Ойролцоогоор огтлолын хавтгайг баруун дээд буланд харуулав.Мутантын эдүүдийн хэсгүүдэд F-актин (S, T) ба миозин IIb (U, V) -ийн будалт нэмэгдсэн байна.3-р зурагт үзүүлсэн in vitro үр дүнтэй адил мутант үр хөврөлд β-катенин (W, X) болон Е-кадхерин (Y, Z)-ийн мембраны будалт сайжирсан байна.(AA-BB) Зэрлэг төрлийн үр хөврөлийн хэсгийн оройн суурь эсийн хилээс цааш харагдах электрон микрографи нь наалдамхай уулзваруудыг илтгэх тодорхой электрон нягт бүсийг харуулж байна (АА, сум).Үүний эсрэгээр, Specc11 мутант үр хөврөлийн хэсгүүдэд (BB, сумнууд) апикобазын уулзвар бүхэлдээ электрон нягттай байдаг нь наалдамхай уулзваруудын нягтрал, тархалт нэмэгдэж байгааг харуулж байна.
Давхарга багассан нь AJ өөрчлөгдсөнтэй холбоотой гэсэн таамаглалыг шалгахын тулд бид Specc1l мутант үр хөврөлийн ил гарсан мэдрэлийн нугалам дахь AJ шошгыг шалгасан (Зураг 5S-Z).Бид актин стресс утас (Зураг. 5S, T) нэмэгдэж, актин утас (Зураг. 5U, V) дээр миозин IIB будах зэрэгцэн нутагшуулах нэмэгдсэн ажиглагдсан.Хамгийн чухал нь бид эс хоорондын хил дээр β-катенин (Зураг 5W,X) болон E-cadherin (Зураг 5Y,Z)-ийн будалт ихэссэнийг ажигласан.Мөн бид E8.5 үр хөврөлийн мэдрэлийн атираа дахь NCC-ийн β-катенины будгийг шалгасан (Зураг 5K, L).Specc1l мутант мэдрэлийн атираа (Зураг 5L ба K)-д β-катенины будалт илүү хүчтэй байсан нь AJ-ийн өөрчлөлт эхэлснийг харуулж байна.E9.5 үр хөврөлийн гавлын ясны хэсгүүдийн электрон микрографик дээр бид Specc1l мутант үр хөврөлийн WT-тэй харьцуулахад электрон нягтаршил ихтэй сарнисан будгийг дахин ажиглав (Зураг 5AA, BB ба S1E-H).Эдгээр үр дүнг нэгтгэн авч үзвэл SPECC1L-kd U2OS эсийн in vitro үр дүнг дэмжиж, хэвийн бус AJ будалт нь мутант үр хөврөлийн CNCC давхаргажилтаас өмнө байгааг харуулж байна.
AKT-ийн үйл ажиллагаа ба E-cadherin-ийн тогтвортой байдлын хоорондох мэдэгдэж буй антагонист хамаарлыг харгалзан бид PI3K-AKT дохионы оролцоог таамаглаж байна.Нэмж дурдахад бид зарим мутант үр хөврөлд E9.5-10.5-д үхлийн аюулаас (<5%) зугтаж, оронд нь E13.5-д суурьшсан (зураг S3) арьсны доорх цэврүүтлийг ажигласан.Арьсны доорх цэврүүтүүд нь PDGFRα12 дээр суурилсан PI3K-AKT дохионы бууралтын шинж тэмдэг юм.Fantauzzo нар.(2014) PdgfraPI3K/PI3K мутант үр хөврөлийн PDGFRα-д суурилсан PI3K идэвхжилтийг тасалдуулснаар арьсны доорх цэврүү, мэдрэлийн хоолойн гажиг, тагнайн сэтэрхий фенотип үүсдэг гэж мэдээлсэн.Үнэн хэрэгтээ, pan-AKT болон идэвхтэй фосфоржуулсан Ser473-AKT-ийн түвшинг Specc1l мутант эдэд in vivo E9.5 үр хөврөлийн баривчлах хүртэл бууруулсан (Зураг 6A-D).Фосфоржуулсан Ser473-AKT-ийн түвшин буурсан нь бүхэлдээ in vivo (Зураг 6E) болон in vitro (Зураг 6F) pan-AKT-ийн түвшин буурсантай холбоотой байж болох юм.U2OS эсүүд эсийн хэлбэр болон AJ нягтын өөрчлөлттэй хүчтэй нийлсэн үед л in vitro бууралт ажиглагдсан (Зураг 6D).Тиймээс бидний мэдээлэл SPECC1L нь гавлын нүүрний морфогенезийн PI3K-AKT дохионы шинэ эерэг зохицуулагч болохыг харуулж байна.
(A–E) E8.5 (A,B) ба E9.5 (C,D) гавлын ясны хэсэг буюу Specc1l мутант үр хөврөлийн (E) E9.5 лизатууд идэвхтэй фосфоржуулсан S473-AKT болон pan-AKT уургийн бууралтын түвшинг харуулсан. , хяналтын WT-тэй харьцуулахад.Баруун blotting нь ижил нөхцөлд зэрлэг төрлийн лизатууд болон мутант лизатууд дээр хийгдсэн.SPECC1L-д үзүүлсэн зургуудыг нэг цэгээс авсан.Ижил толбыг арилгаж, анти-пан-ACT болон β-актины эсрэгбиемүүдээр дахин шалгасан.E8.5 мэдрэлийн атираа (A, B) дахь Pan-AKT түвшин болон E9.5 гавлын ясны хэсгүүдэд фосфоржуулсан S473-AKT-ийн түвшин мэдэгдэхүйц буурсан байна.(F) Өндөр уулзварт цуглуулсан SPECC1L-kd U2OS эсийн лизатуудад Pan-AKT түвшин мөн адил буурсан байна.Алдааны мөр нь гурван бие даасан Western blot хэмжигдэхүүнээс авсан SEM-ийг төлөөлдөг.(GJ) E9.5 дахь WT үр хөврөлийн хэсгүүдийг KI67-ээр будаж, 3-р каспазыг тус тусад нь салгаж, эсийн үржих (G, G') ба апоптозын идэвхжил (H, H') бага байгааг харуулж байна.Specc11 мутант үр хөврөл нь харьцуулж болохуйц эсийн өсөлтийг (I) харуулдаг боловч апоптозд өртөж буй эсийн тоо мэдэгдэхүйц нэмэгддэг (J).
Дараа нь бид пролифераци ба апоптозын маркеруудыг шалгасан.Бид E9.5 үр хөврөлийн үржлийн (Зураг 6E, G I-тэй харьцуулахад) ямар ч ялгааг ажиглаагүй бөгөөд KI67 будалтаар хэмжсэн WT мутантуудын хувьд 82.5%, Specc1l мутантуудын хувьд 86.5% (p<0.56, Fisher's) үржлийн индекстэй байна. яг туршилт).Үүний нэгэн адил бид үр хөврөл баривчлах хүртэл (зураглаагүй) (зураглаагүй) E8.5-ийн мэдрэлийн нугалам дахь задарсан каспаз 3-ыг будах замаар хэмжсэн апоптозын ялгааг ажиглаагүй.Үүний эсрэгээр, апоптоз нь бүх E9.5 мутант үр хөврөлд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 6F, H ба J).Апоптозын нийт өсөлт нь PI3K-AKT дохиолол багасч, үр хөврөлийн эрт үхэлд хүргэдэг29,30,31.
Дараа нь бидний kd эсүүд дэх AJ өөрчлөлтөд PI3K-AKT дохиололд учир шалтгааны үүргийг баталгаажуулахын тулд бид хяналтын болон kd эсийн замыг химийн аргаар өөрчилсөн (Зураг 7A-F).Бид нийлсэн SPECC1L-kd эсүүдэд ажиглагдсан эсийн хэлбэрийн өөрчлөлтийн фенотипийг маркер болгон ашигласан бөгөөд бид үүнийг хамгийн урт хэмжээс (урт) болон харгалзах босоо хэмжээс (өргөн)-ийн харьцааг ашиглан хэмжигдэхүүнийг тодорхойлсон.Харьцангуй бөөрөнхий эсвэл шоо хэлбэртэй эсийн хувьд 1 харьцаатай байна (Зураг 7G).Эсийн хэлбэрээс гадна бид β-катенин будгаар AJ-д үзүүлэх нөлөөг баталгаажуулсан (Зураг 7A'-F').Вортманниныг ашиглан PI3K-AKT замыг дарангуйлах нь хяналтын эсүүд (Зураг 7A,C) болон AJ (Зураг 7А') дахь эсийн хэлбэрийг өөрчлөхөд хангалттай байв.PI3K-AKT идэвхжүүлэгч SC-79 нь хяналтын эсүүдэд эсийн хэлбэр (Зураг 7А, Е) эсвэл AJ тэлэлт (Зураг 7А') нөлөөлсөнгүй.SPECC1L-kd эсүүдэд PI3K-AKT замыг цаашид дарангуйлснаар апоптоз нэмэгдэж (Зураг 7B,D) болон β-катенины будалт мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 7B') нь бидний in vivo хүнд мутантуудтай нийцдэг.Хамгийн чухал нь PI3K-AKT замыг идэвхжүүлснээр эсийн хэлбэр (Зураг 7B,F) болон AJ фенотипүүд (Зураг 7B") мэдэгдэхүйц сайжирсан.Эсийн хэлбэрийн өөрчлөлтийг эсийн бөөрөнхий харьцаа (CCR) гэж тооцож, дээр дурдсанчлан ач холбогдлыг нь харьцуулсан (Зураг 7G).Үнэн хэрэгтээ хяналтын эсүүдэд (Зураг 7G, CCR = 1.56) wortmannin эмчилгээ нь эсийн хэлбэрийг мэдэгдэхүйц өөрчлөхөд хангалттай байсан (Зураг 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) ажиглагдсантай ижил хэмжээгээр SPECC1L-д.-kd эсүүд (Зураг 7G, CCR = 3.46).Wortmannin SPECC1L-kd эсийн эмчилгээ (Зураг. 7G, CCR = 3.60, үл тоомсорлодог) нь эмчилгээ хийгээгүй kd эсүүд (Зураг 7G, CCR = 3.46, үл тоомсорлодог) эсвэл wortmannin-ээр эмчилсэн хяналтын эсүүдээс илүү ач холбогдолтой байсангүй (Зураг 7G)., CCR = 3.46, үл тоомсорлодог) нь эсийн суналтад нэмэлт нөлөө үзүүлдэг (7G, CCR = 3.61, үл тоомсорлодог).Хамгийн чухал нь SC-79 AKT идэвхжүүлэгч нь SPECC1L-kd эсийн уртассан фенотипийг сэргээсэн (Зураг 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Эдгээр үр дүн нь SPECC1L нь PI3K-AKT дохиололыг зохицуулдаг болохыг баталж, SPECC1L-ийн дунд зэргийн бууралт нь эсийн наалдацанд нөлөөлдөг бол хүчтэй бууралт нь апоптозд хүргэдэг (Зураг 8).
(A–F') PI3K-AKT замын дарангуйлагч wortmannin (C, D) эсвэл SC-79 идэвхжүүлэгч (E, F) -аар эмчилсэн хяналтын (A, C, E) болон SPECC1L-kd (B, D, F) эсүүд. .Эмчилгээгүй хяналтын эсүүд нь шоо хэлбэртэй (A) хэвийн β-муурны эсийн будалттай (A'), харин kd эсүүд нь уртассан (B) β-муурын будалт ихэссэн (B').PI3K-AKT замыг дарангуйлсны дараа хяналтын эсүүд β-муурын тэлэлттэй (C') уртассан (C) бол kd эсүүд нь манай өндөр мутацтай үр хөврөлтэй адил апоптоз (D) -д орж эхэлсэн бөгөөд β-муурыг маш сайжруулсан.будалт (D').PI3K-AKT замыг идэвхжүүлсний дараа хяналтын эсүүд куб хэлбэртэй (E) хэвээр үлдэж, хэвийн β-муур (E') будалттай байсан бол kd эсүүд эсийн хэлбэр (F) болон β-муур (F') мэдэгдэхүйц сайжирсаныг харуулж байна. (G) MetaMorph программ хангамжийг ашиглан хамгийн урт хэмжээс (урт) болон харгалзах босоо хэмжээс (өргөн)-ийн эсийн бөөрөнхий харьцаа (CCR) ашиглан (AF) эсийн хэлбэрийн өөрчлөлтийн түвшинг тодорхойлсон.Эмчилгээ хийлгээгүй (NT) SPECC1L-kd эсүүд (CCR = 3.46) хяналтын эсүүдээс хамаагүй урт байсан (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Wort-ийн хяналтын эс дэх PI3K-AKT замыг дарангуйлах нь эсийн хэлбэрийн ижил төстэй уртасгахад хангалттай байсан (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Үүний нэгэн адил, SPECC1L-kd эсүүдэд SC-79-ээр AKT идэвхжүүлснээр эсийн суналтыг хяналтын түвшинд хүртэл сэргээсэн (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd эсүүдэд Вортманнинаар эмчилгээ хийснээр апоптоз нэмэгдсэн боловч .ns = хамаагүй.+/- 50 эсийн SEM хэмжилтийг үзүүлэв.Статистикийн зөрүүг Стьюдентын t-тест ашиглан тооцоолсон.
(A) PI3K-AKT замыг дарангуйлах, идэвхжүүлэх бүдүүвч дүрслэл нь AJ-ийн өөрчлөлт болон аврахад хүргэдэг.(B) SPECC1L-ээр AKT уургийг тогтворжуулах санал болгож буй загвар.
Урьдчилан суурьшсан CNCC нь AJ задралыг урд талын мэдрэлийн нугаламын нейроэпителийн эсүүдээс салгахыг шаарддаг1,15,32.AJ-ийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн будалт нэмэгдэж, SPECC1L-ийн дутагдалтай эсүүдэд in vitro болон in vivo аль алинд нь оройн-суурь AJ тэгш бус тархалт алдагдаж, SPECC1L-ийн β-катенинтай бие махбодийн ойролцоо байгаа нь SPECC1L нь AJ-ийн орон нутгийн тогтвортой байдлыг зохих ёсоор хангадаг болохыг харуулж байна. зохион байгуулалтын булчингууд.актин эсийн араг яс.SPECC1L нь актин эсийн араг яс ба β-катенинтэй холбоотой байх ба SPECC1L байхгүй үед конденсацлагдсан актин утаснуудын тоо нэмэгдэж байгаа нь AJ нягтралын ажиглагдсан өсөлттэй нийцэж байна.Өөр нэг боломж бол SPECC1L-ийн дутагдалтай эсүүдэд актин утаснуудын тоо нэмэгдэх нь эс хоорондын хурцадмал байдлыг өөрчлөхөд хүргэдэг.Эсийн стресс нь AJ 33 динамик байдалд нөлөөлдөг тул хүчдэлийн өөрчлөлт нь илүү сарнисан AJ 34-ийг үүсгэдэг.Тиймээс аливаа өөрчлөлт нь CNCC давхаргад нөлөөлнө.
Wnt1 нь мэдрэлийн эсийн эсийг үүсгэдэг эрт үеийн мэдрэлийн нугалахад илэрдэг.Тиймээс Wnt1-cre удамшлын ул мөр нь NCC35-ын өмнөх болон шилжин суурьшсаныг хоёуланг нь тэмдэглэдэг.Гэсэн хэдий ч Wnt1 нь мөн эрт мэдрэлийн нугалаас гаралтай нурууны тархины эд эсийн клоныг тэмдэглэдэг 35,36, энэ нь нээлттэй мэдрэлийн нугалам дахь Wnt1 маркеруудын E9.5 мутантуудын бидний будалт нь CNCC биш байх магадлалтай.AP2A болон SOX10 NCC маркерууд дээр бидний эерэг будалт нь Specc11 мутант үр хөврөлийн ил гарсан мэдрэлийн атираа нь үнэхээр CNCC агуулсан болохыг баталсан.Нэмж дурдахад AP2A болон SOX10 нь эрт шилжин суурьшсан ХСС-ийн маркерууд тул эерэг будалт нь эдгээр эсүүд нь нүүдлийн дараах CNCC бөгөөд E9.5-аар давхраажих боломжгүй болохыг харуулж байна.
Бидний өгөгдөл нь AJ-ийн SPECC1L-ийн молекулын зохицуулалтыг PI3K-AKT дохиогоор дамжуулж байгааг харуулж байна.SPECC1L дутагдалтай эс, эдэд AKT дохио багасдаг.Fantauzzo et al.гавлын нүүрний морфогенезид PI3K-AKT дохионы шууд үүргийг дэмждэг.(2014) PDGFRα-д суурилсан PI3K-AKT дохиолол идэвхжихгүй байгаа нь тагнайн сэтэрхий фенотип үүсэхэд хүргэдэг болохыг харуулсан.Мөн PI3K-AKT замыг дарангуйлах нь U2OS эсийн AJ болон эсийн хэлбэрийг өөрчлөхөд хангалттай гэдгийг бид харуулж байна.Бидний олж мэдсэнтэй нийцэж байгаа Каин нар.37-аас үзэхэд эндотелийн эс дэх PI3K α110 дэд нэгжийн бууралт нь "холболтын индекс"-ийн өсөлт гэж нэрлэгддэг эсийн гаднах β-катенины будалт ижил төстэй өсөлтөд хүргэдэг.Гэсэн хэдий ч актин утаснууд нь аль хэдийн өндөр зохион байгуулалттай байдаг эндотелийн эсүүдэд PI3K-AKT замыг дарангуйлснаар эсийн сул хэлбэр үүсдэг.Үүний эсрэгээр SPECC1L-kd U2OS эсүүд уртассан эсийн хэлбэрийг харуулсан.Энэ ялгаа нь эсийн төрөл байж болно.PI3K-AKT дохиог дарах нь актин эсийн араг ясанд байнга нөлөөлдөг боловч эсийн хэлбэрт үзүүлэх нөлөөг төвийн актины утаснуудын нягтрал, зохион байгуулалтын өөрчлөлтөөс үүдэлтэй хурцадмал байдлын өөрчлөлтөөр тодорхойлдог.U2OS эсүүдэд бид зөвхөн эсийн хэлбэрийн өөрчлөлтийг SPECC1L-ийн дутагдалтай AJ өөрчлөлт, нөхөн сэргээх тэмдэг болгон ашигласан.Эцэст нь хэлэхэд, SPECC1L-ийн дутагдлын үед AKT замыг дарангуйлах нь AJ-ийн тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлж, CNCC-ийн деламинацийг бууруулдаг гэж бид таамаглаж байна.
Сонирхолтой нь, SPECC1L байхгүй үед фосфоржуулсан 473-AKT түвшингээс гадна in vitro болон in vivo pan-AKT-ийн түвшинг бууруулсан нь AKT уургийн тогтвортой байдал эсвэл эргэлтийн түвшинд PI3K-AKT дохионы зохицуулалтыг санал болгож байна.Opitz/GBBB хам шинжтэй холбоотой SPECC1L ба MID1 генүүд нь микротубулуудыг тогтворжуулдаг уургийг кодлодог 18,22.SPECC1L ба MID1 нь бичил гуурсан хоолойн тогтворжилтыг зуучлах механизмыг бүрэн ойлгоогүй байна.SPECC1L-ийн хувьд энэхүү тогтворжилт нь микро гуурсан хоолойн дэд бүлгийн 18 сайжруулсан ацетилжилтийг агуулдаг.SPECC1L нь AKT зэрэг бусад уургийг тогтворжуулахын тулд ижил төстэй механизм ашигладаг байж магадгүй юм.AKT уураг дахь лизин үлдэгдлийг ацетилжуулах нь мембраны локалчлал, фосфоржилт буурахад хүргэдэг38.Нэмж дурдахад, мембраныг нутагшуулах, идэвхжүүлэхэд AKT дээрх ижил лизин үлдэгдэл дээр K63 гинжийг хаа сайгүй байрлуулах шаардлагатай39,40.Янз бүрийн өндөр хүчин чадалтай мөөгөнцрийн хоёр эрлийз дэлгэц дээр тодорхойлогдсон SPECC1L уургуудтай харилцан үйлчлэлцдэг хэд хэдэн хүчин зүйлсийн дотроос дөрөв нь CCDC841, ECM2942, APC болон UBE2I43 нь уургийн эргэлт эсвэл хаа сайгүй сумойляциар дамжин тогтворжуулахад нөлөөлсөн байдаг.SPECC1L нь AKT-ийн тогтвортой байдалд нөлөөлж, AKT лизин үлдэгдлийг орчуулсны дараах өөрчлөлтөд оролцуулж болно.Гэсэн хэдий ч AKT уургийн нутагшуулалт, тогтвортой байдалд SPECC1L-ийн чухал үүргийг тодруулах шаардлагатай хэвээр байна.
In vivo SPECC1L-ийн илэрхийлэлд ноцтой согогууд нь AJ маркерын будалт, CNCC давхаргын гэмтэл, түүнчлэн апоптоз болон үр хөврөлийн эрт үхэлд хүргэдэг.Апоптозын түвшин ихэссэн хулганы мутантууд нь мэдрэлийн хоолойн гажиг 44,45,46,47, гавлын нүүрний гажигтай48 холбоотой болохыг өмнөх тайлангууд харуулсан.Мэдрэлийн нугалам эсвэл залгиурын нуман дахь эсийн хэт их үхэл нь морфогенетик зөв хөдөлгөөнд шаардлагатай эсийн тоо хангалтгүй байж болзошгүй гэж үздэг 48,49,50.Үүний эсрэгээр манай SPECC1L-ийн дутагдалтай, дунд зэргийн бууралттай SPECC1L-ийн илэрхийлэл нь эсийн үхэл нэмэгдсэнийг нотлохгүйгээр зөвхөн AJ-ийн өөрчлөлтийг харуулсан.Гэсэн хэдий ч эдгээр Kd эсүүдэд PI3K-AKT замыг химийн дарангуйлснаар апоптоз нэмэгдсэн байна.Тиймээс SPECC1L-ийн илэрхийлэл эсвэл үйл ажиллагааны дунд зэргийн бууралт нь эсийн амьд үлдэх баталгаа болдог.Энэ нь ховор Specc11 мутант үр хөврөлийг st.E9.5 - магадгүй ген барих үр ашиг багассантай холбоотойгоор мэдрэлийн гуурсыг хааж, хожим нь гавлын нүүрний гажиг үүсэх үед зогсох боломжтой байдаг (Зураг S3).Гетерозигот Specc1l үр хөврөл гавлын нүүрний гажигтай ховор тохиолдох нь ген барих үр ашгийг нэмэгдүүлсэнтэй холбоотой байж магадгүй, мөн тахө загасанд SPECC1L хоёр ортологийн аль нэг нь (specc1lb) үр хөврөлийн хожуу үеийн фенотип алдагдах шалтгаан болдог нь үүнтэй нийцэж байна. доод эрүү ба хоёр талын хагарал51.Тиймээс хүний ​​өвчтөнд илэрсэн гетерозигот SPECC1L-ийн үйл ажиллагааны алдагдал нь гавлын нүүрний морфогенезийн үед SPECC1L-ийн үйл ажиллагаанд бага зэргийн эмгэг үүсгэдэг бөгөөд энэ нь тэдний амны хөндийн ан цавыг тайлбарлахад хангалттай юм.SPECC1L-д суурилсан эс хоорондын контактуудын зохицуулалт нь залгиурын нуман хаалганы палатогенез болон нэгдэхэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.SPECC1L-ийн үйл ажиллагааны цаашдын судалгаа нь нейроэпителийн эсийн хөдөлгөөн ба гавлын нүүрний морфогенезийн мэдрэлийн хоолой хаагдах үед CNCC-ийн түр зуурын эс хоорондын контактуудын үүргийг тодруулахад тусална.
U2OS остеосаркомын хяналт ба SPECC1L-kd эсийг өмнө нь тайлбарласан (Saadi et al., 2011).SPECC1L-ийн эсрэг эсрэгбиемүүдийг урьд өмнө нь тодорхойлж байсан (Saadi et al., 2011).Anti-β-катенин эсрэгбие (туулай; 1:1000; Санта Круз, Даллас, Техас) (хулгана; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), миозин IIb (1:1000; Сигма-Алдрих, Сент Луис) ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Абкам, Кембридж, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Коло.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан Диего) , Калифорниа), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), хуваагдсан каспаз 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) болон β-актин (1:2500; Сигма-Алдрих, Сент Луис, MO )-г тайлбарласны дагуу ашигласан..Актин утаснуудыг Acti-stain rhodamine phalloidin-ээр будсан (Цитоскелетон, Денвер, Колорадо).
U2OS хяналтын эсүүд болон SPECC1L-kd эсүүдийг 10% ургийн үхрийн ийлдэс (Life Technologies, Carlsbad, CA) нэмсэн стандарт өндөр глюкозын DMEM-д өсгөвөрлөв.AJ-ийн өөрчлөлтийн хувьд 2 х 105 эсийг 0.1% гахайн желатин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) боловсруулсан шилэн дээр суулгаж, эсийн хэлбэрийн өөрчлөлтийг ажиглав.Үрийг суулгаснаас хойш 4 цагийн дараа (t = 1), тариалснаас хойш 24 цагийн дараа (t = 2), эсийн хэлбэр өөрчлөгдөөгүй нэгдэл (t = 3), эсийн хэлбэр өөрчлөгдөх (t = 4) -ийг заасан өөр өөр цэгүүдэд эсүүдийг цуглуулсан. , эсийн хэлбэр өөрчлөгдсөнөөс хойш 24 цагийн дараа (t = 5), эсийн хэлбэр өөрчлөгдсөнөөс 48 цагийн дараа (t = 6) (Зураг 1, 2, 3).PI3K-AKT замыг модуляцлахын тулд эсийг заасан концентрацид PI3K-AKT дарангуйлагч wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) эсвэл SC-79 идэвхжүүлэгч (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) ашиглан өсгөвөрлөсөн.Химийн бодис агуулсан орчинг өдөр бүр сольж байсан.
Хэвийн өсгөвөрийн нөхцөлд амьд хяналтын болон KD эсүүд дээр жааз тус бүрээр бичлэг хийж, фазын тодосгогч дүрсийг 7 хоногийн турш 10 минут тутамд цуглуулсан.Зургийг QImaging Retiga-SRV камертай холбосон механик шат болон 10 × N-PLAN объектоор тоноглогдсон компьютерийн удирдлагатай Leica DM IRB урвуу микроскоп ашиглан авсан.Дүрслэл хийх явцад эсийн өсгөвөрийг 5% CO2 бүхий чийглэг орчинд 37°С хэмд байлгасан.
Бүс нутгийн мутант хулганы нөөцийн төвөөс (UC Davis, CA) хоёр генийн урхины ES эсийн шугам DTM096 ба RRH048-ийг Specc1lgtDTM096 болон Specc1lgtRRH046 гэж тодорхойлсон Specc11 дутагдалтай хулганы шугамыг бий болгоход ашигласан.Товчхондоо, 129/REJ ES эсийг C57BL6 бластоцистуудад тарьсан.Үүссэн химерик эр хулганыг эм C57BL6 хулганаар үржүүлж, агути бүрхүүлийн өнгөтэй үр удмыг таньсан.Гетерозиготуудыг тодорхойлохын тулд генийн урхины вектор оруулга байгаа эсэхийг ашигласан.Хулганыг 129/REJ;C57BL6-ийн холимог дэвсгэр дээр байлгасан.Генетик урхины векторыг оруулах газрын байршлыг RT-PCR, геномын дараалал, генетикийн нэмэлтээр баталгаажуулсан (Нэмэлт Зураг 1).Давхар гетерозигот Specc1lGT хулгануудын CNCC удамшлыг судлахын тулд ROSAmTmG (#007576) ба Wnt1-Cre (#003829) хулгануудыг (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) гаталж, ROSAmTmG ба Wnt1-Cre аллелентийг гаргаж авсан.Хулганад хийсэн бүх туршилтыг Канзасын Анагаах Ухааны Төвийн Их Сургуулийн Амьтдыг арчлах, ашиглах хорооноос баталсан протоколын дагуу хийсэн.
Үр хөврөлийг тасалгааны температурт 60 минутын турш (1% формальдегид, 0.2% глутаральдегид, 2 мМ MgCl2, 0.02% NP-40, 5 мм EGTA) тогтоов.X-gal будгийн уусмалд (5 мМ калийн феррицианид, 5 мм калийн ферроцианид, 2 мм MgCl2, 0.01% натрийн дезоксихолат, 0.02% NP-40, 1 мг/мл X-гал) бэхэлсэний дараа 37°C-т толбо боловсруулав. .1-6 цагийн дотор °C.Үр хөврөлийг 4% PFA-д суулгаж, дүрсэлсэн.
Western blotting-ийн хувьд эсийг идэвхгүй задралын буферт (Promega, Fitchburg, WI) задалсан бөгөөд HALT протеазын дарангуйлагч (Sigma-Oldrich, St. Louis, MO) холимогоор баяжуулсан.Лизатуудыг 12% полиакриламидын Mini-PROTEAN TGX бэлэн гель (Bio-Rad, Hercules, CA) дээр боловсруулж, Immobilon PVDF мембран (EMD Millipore, Billerica, MA) руу шилжүүлэв.0.1% Tween агуулсан PBS дахь 5% сүүнд мембраныг блоклосон.Эсрэгбиемүүдийг шөнийн турш 4 ° C температурт эсвэл өрөөний температурт нэг цагийн турш өсгөвөрлөсөн.Femto SuperSignal West ECL урвалжийг (Thermo Scientific, Waltham, MA) дохио үүсгэхэд ашигласан.Дархлаа тогтоохын тулд үр хөврөлийг нэг шөнийн дотор 4% PFA/PBS-д тогтоож, крио хадгалсан.Эд эсийн криосексийг 1% хэвийн ямааны ийлдэс (Thermo Scientific, Waltham, MA) болон 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) агуулсан PBS-д хааж, дараа нь инкубаторт 4°С-т өсгөвөрлөсөн. шөнө.эсрэгбие болон флюресцент хоёрдогч эсрэгбиетэй (1:1000) 40С-т 1 цагийн турш.Будсан хэсгүүдийг ProLong алтны орчинд (Thermo Scientific, Waltham MA) байрлуулж, Leica TCS SPE конфокаль микроскоп ашиглан хавтгай зургийг авсан.Дархлаа будалт бүрийг дор хаяж хоёр мутант үр хөврөлийн цироссекция дээр гурван бие даасан туршилт болгон хийсэн.Төлөөлөгч туршилтыг үзүүлэв.
Эсүүдийг өөрчилсөн RIPA буферт (20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1% NP-40, 130 мм NaCl, 10% глицерин, 2 мм EDTA, HALT протеазын дарангуйлагч (Sigma-Aldrich, St. LouisMO)) өсгөвөрлөсөн. Товчхондоо, лизатуудыг уургийн G соронзон бөмбөлгөөр (Life Technologies, Карлсбад, CA) урьдчилан цэвэршүүлж, дараа нь 4°С-т шөнийн турш өсгөвөрлөсөн. SPECC1L эсвэл IgG уураг G уургийн ирмэгээр SPECC1L-ийг гаргаж авахын тулд эсрэг бодис ашиглан Western blotting хийсэн. Дээр дурдсан -β-катенины эсрэгбие Үзүүлсэн co-IP туршилтууд нь бие даасан дөрвөн туршилтыг төлөөлдөг.
Тогтмол өсгөвөрлөсөн эсүүд эсвэл хулганы үр хөврөлийн эдийг Канзасын их сургуулийн Анагаах ухааны төвийн электрон микроскопийн төвд өгсөн.Товчхондоо дээжийг EMbed 812 давирхайд (Электрон микроскопийн шинжлэх ухаан, Форт Вашингтон, ПХУ) суулгаж, 60°С-т нэг шөнийн турш полимержуулж, алмаазан ирээр тоноглогдсон Leica UC7 хэт микротомыг ашиглан 80 нм-т хуваасан.Хэсгүүдийг 100 кВ-ын Lab6 буугаар тоноглогдсон JEOL JEM-1400 дамжуулагч электрон микроскоп ашиглан дүрсэлсэн.
Энэ өгүүллийг хэрхэн иш татах вэ: Wilson, NR et al.SPECC1L-ийн дутагдал нь холбосон үений тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлж, гавлын мэдрэлийн эсүүдийн деламинацийг бууруулдаг.шинжлэх ухаан.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Сент-Жан, Ж.-П.Мэдрэлийн зангилааны индукц ба ялгаа.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Хөдөлгөөнд байгаа гавлын мэдрэлийн эсүүд: гавлын нүүрний хөгжилд гүйцэтгэх үүрэг.Америкийн анагаах ухааны генетикийн сэтгүүл.А хэсэг 155А, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, RP Neurocristopathia: 20 жилийн хугацаанд түүний өсөлт, хөгжил.Хүүхдийн эмч.эмгэг.лаборатори.эм.17, 1–25 (1997).
Манголд Э., Людвиг К.У, Нотен М.М. Нүүрний ан цавын генетикийн нээлт.Молекулын анагаах ухааны чиг хандлага 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Мину, М., Райли, ФМ. Гавлын мэдрэлийн эсийн шилжилт хөдөлгөөн ба гавлын нүүрний хөгжлийн үеийн хэв маягийн молекулын механизмууд.Хөгжил 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Диксон, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH болон Murray, JK сэтэрхий уруул, тагнай: генетик ба хүрээлэн буй орчны нөлөөллийг ойлгох.байгалийн сэтгэгдэл.Генетик 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Интерфероныг зохицуулах хүчин зүйл-6 (Irf6) дутагдалтай хулганад арьс, мөч, гавлын нүүрний бүсийн хэвийн бус морфогенез.Үндэсний Женет.38, 1335–1340, дой: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3-ийн давамгайлсан мутаци нь ван дер Ваордын хам шинжийг үүсгэж, амны хөндийн перидермийн хөгжлийг сааруулдаг.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Харрис, М.Ж., Журилофф, Д.М. Мэдрэлийн гуурс хаагдахад согогтой хулганы мутантуудын жагсаалтыг шинэчилж, мэдрэлийн гуурсан хоолойн хаалтын талаарх генетикийн бүрэн ойлголтыг ахиулна.Төрөлхийн гажиг судлах.А хэсэг, Клиник ба молекул тератологи 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K зуучлалын PDGFRalpha дохио нь p53-аас хамааралтай эсийн доторх замаар араг ясны хөгжилд эсэн мэнд үлдэх, үржихийг зохицуулдаг.Генийн хөгжил 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND болон Murdoch, JN Disheveled: Конвергент тэлэлтийн мэдрэлийн хоолойн хаалттай хамаарал.Мэдрэл судлалын чиг хандлага.26, 453–455, дой: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).