310 10*1мм Зэвэрдэггүй ган ороомог хоолойн химийн бүрэлдэхүүн хэсэг, Спидроины N-терминал домайнууд нь амилоид фибрил дээр суурилсан гидрогель үүсгэдэг бөгөөд уургийг хөдөлгөөнгүй болгох платформыг бүрдүүлдэг.

Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.
Слайд бүрт гурван өгүүллийг харуулсан слайдерууд.Слайдуудын дундуур шилжихийн тулд буцах болон дараагийн товчлууруудыг, слайд бүрээр шилжихийн тулд төгсгөлд байрлах слайд хянагчийн товчлууруудыг ашиглана уу.

Тодорхойлолт

310 10*1мм зэвэрдэггүй ган ороомог хоолой нийлүүлэгчид

Химийн найрлага

Механик шинж чанарууд

Рекомбинант аалзны торгоны уураг (аалзны торгоны уураг) нь шинэ биоматериал боловсруулахад олон боломжит хэрэглээтэй боловч тэдгээрийн олон талт, бөөгнөрөлд өртөмтгий шинж чанар нь тэдгээрийг олж авахад хэцүү, хэрэглэхэд хялбар болгодог.Энд бид рекомбинант бяцхан спидроины уургууд, хамгийн чухал нь N-терминал домэйн (NT) нь өөрөө 37 ° C-ийн температурт өөрийгөө дэмждэг, тунгалаг гидрогелүүдийг хурдан үүсгэдэг болохыг бид мэдээлж байна.NT ба ногоон флюресцент уураг эсвэл пурины нуклеозид фосфорилазаас бүрдэх нэгдэх уургууд нь бүрэн ажиллагаатай нэгдэх уураг үүсгэдэг.Гидрогель.Бидний үр дүнгээс үзэхэд рекомбинант NT ба хайлуулах уургууд нь экспрессийн өндөр гарцыг өгч, гидрогельд тунгалаг байдал, хөндлөн холбоосгүй гель үүсэх, идэвхтэй уургийг өндөр нягтралд шууд хөдөлгөөнгүй болгох зэрэг сонирхол татахуйц шинж чанартай болохыг харуулж байна.
Аалзнууд долоон янзын торгон булчирхайтай бөгөөд тус бүр нь тодорхой төрлийн торго үүсгэдэг.Торгоны бүх долоон зүйл нь 6000 орчим үлдэгдэл урттай аалзны торгоны уургуудаас (спидроин) тогтдог бөгөөд бөмбөрцөг хэлбэрийн N- ба С-терминалуудаар хүрээлэгдсэн томоохон төв давталтын бүсийг агуулдаг (NT ба CT)1,2.Хамгийн их судлагдсан торгоны төрөл болох анхдагч ампулыг анхдагч ампулын булчирхайгаар үйлдвэрлэдэг.Энэ булчирхайд эпителийн эсийн нэг давхарга нь спидроины уураг нийлэгжүүлэн булчирхайн хөндийд ялгаруулж, уусдаг хэлбэрээр (допинг) маш өндөр концентрацитай (30-50% х/х) байдаг3,4.Булчирхай дахь гол ампуляр спидроины уургуудын зохион байгуулалт, конформацийн талаар маргаантай байгаа боловч ихэнх туршилтын нотолгоо нь ерөнхийдөө мушгиа ба/эсвэл санамсаргүй мушгиа хэлбэрийн конформаци, мицелляр эсвэл давхаргын бүтэц байгааг харуулж байна5,6,7,8,9,10.Дахин давтагдах домэйнууд нь торгоны утаснуудын механик шинж чанарыг зохицуулж, β хуудас нано талстууд болон аморф бүтцийг бий болгодог11,12,13,14,15, төгсгөлийн домэйнууд нь торгоны булчирхайн дагуух нөхцөлийн өөрчлөлтийн хариуд торгоны утаснуудыг зохицуулдаг16,17,18.Торгоны формацийг хянаснаар 19. Терминал домэйнууд хувьслын хувьд хадгалагдан үлддэг бөгөөд тэдгээрийн үйл ажиллагаа нь бүх спидроины уургуудад нийтлэг байж болно 2,20,21.Булчирхайгаар дамжин өнгөрөх үед спидроины рН нь ойролцоогоор 7.6-аас < 5.716 болж буурч, аажмаар нарийсч буй сувгаар дамжин өнгөрөх хөдөлгөөнөөр зүсэх, сунах үед нэмэгддэг.Уусмал дахь CT нь α-мушгиа үүсгэгч параллель димер17 боловч бага рН ба зүсэх хүчний хариуд CT нь нээгдэж, β-давхарга16, 17-г сольж, Convert 16-ийн давтагдах хэсгүүдэд β-давхаргыг өдөөдөг. булчирхайн хөндийн нөхцөл байдлыг тусгасан нөхцөл байдал нь спидроины уусах чадварыг зуучлах боловч рН буурсан үед олон тооны карбоксилын хүчлийн хажуугийн гинжин хэлхээний протонжуулалт нь ойролцоогоор 6.5 pKa-тай NT-ийн димеризацид хүргэдэг бөгөөд ингэснээр NT-ийг тогтворжуулж, спидроиныг их хэмжээгээр тогтооно. тоо хэмжээ.сүлжээнүүд16,18.Иймээс NT нь утас үүсэхэд гол үүрэг гүйцэтгэдэг бөгөөд бүрхүүл дэх мономерээс шилэн доторх димер болж өөрчлөгддөг23,24,25.NT нь өнөөг хүртэл судлагдсан 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 бүх нөхцөлд маш сайн уусдаг, мушгиа хэвээр байгаа нь гетерологийн уураг үйлдвэрлэхэд уусах чадварыг сайжруулдаг шошго болгон хөгжүүлэхэд түлхэц болсон.
Нэг NT, нэг богино давталтын бүс, нэг CT, цэвэршүүлэхэд зориулагдсан His6 шошго (His-NT2RepCT) -ээс бүрдсэн рекомбинант мини аалзны торгон уураг нь уугуул аалзны торгоны уураг шиг усан буферт уусдаг бөгөөд торгон аалзны унаган чухал шинж чанарыг дуурайдаг. .хамрах хүрээ 25.31.His-NT2RepCT нь рН 525, 32, 33, 34, 35 усан ваннд рН 8 уусдаг бүрээсийг шахдаг биомиметик машин ашиглан тасралтгүй утас болгон ээрэх боломжтой.His-NT2RepCT-ийг илэрхийлсэн E. coli-ийн биореакторын исгэх ба дараагийн эмчилгээний дараа цэвэршүүлсний дараа >14 г/л ургац авсан.His-NT2RepCT-ийн өндөр гарц, өндөр уусах чадвар, хүчиллэг нөхцөлд хангалттай хариу үйлдэл үзүүлэх нь бүгд NT23, 25, 34-тэй холбоотой.
Энд бид уургийн уусмалыг 37 0С-т өсгөвөрлөх замаар рекомбинант спидроины уургуудаас тунгалаг гидрогель, түүний дотор дангаараа NT-ээс хурдан үүссэнийг мэдээлэв.Тиофлавин Т флуоресценц (ThT), Фурье хувиргах хэт улаан туяаны спектроскопи (FTIR), цөмийн соронзон резонансын спектроскопи (NMR) болон дамжуулагч электрон микроскопи (TEM) ашиглан бид NT болон микро аалзны уургууд нь β хуудас болон амилоид шиг фибриллүүд болж бүтцийн өөрчлөлтөд ордог болохыг олж мэдсэн. гель үүсэх үед.Нэмж дурдахад, NT ба ногоон флюресцент уураг (GFP) эсвэл пурины нуклеозид фосфорилаза (PNP) -ийн нэгдэх уургууд нь бүрэн ажиллагаатай хайлуулах хэсгүүдтэй гидрогель үүсгэдэг.Физиологийн нөхцөлд гидрогелийн хурдацтай үүсэх зэрэг нь гетерологийн хостуудад өндөр үр дүнтэй илэрхийлэл нь инженерийн функцтэй гидрогелийг хэмнэлттэй үйлдвэрлэх боломжийг нээж өгдөг.
Ихэнх мэдээлэгдсэн рекомбинант спидроины уургуудаас ялгаатай нь36 His-NT2RepCT нь рН 8-д Tris-HCl буферт тогтвортой бөгөөд хур тунадасгүй 500 мг/мл хүртэл концентрацитай байдаг25.Тиймээс бид энэ уураг 37°С-д өсгөвөрлөхөд оптикийн тунгалаг, бие даасан гидрогель үүсгэдэг болохыг олж мэдээд бид гайхсан (Зураг 1b-d).Цаашдын судалгаагаар His-NT2RepCT гелац нь уургийн өргөн хүрээний концентрацид (10-300 мг/мл) тохиолдож, энэ концентраци гель үүсэх хугацаатай урвуу хамааралтай болохыг харуулсан (Зураг 1c ба Нэмэлт зураг 1).His-NT2RepCT-ийн аль хэсэг нь гидрогелийн үүслийг зуучилж байгааг олж мэдэхийн тулд бид колбоны урвуу урвалын шинжилгээг ашиглан домэйн бүрийг тус тусад нь болон янз бүрийн хослолоор шалгасан (Зураг 1a,b).Туршилтанд орсон рекомбинант спидроины бүх фракцууд нь тунадасжуулсан 2Rep-ээс бусад тохиолдолд 1 цаг хүрэхгүй хугацаанд (300 мг/мл уургийн концентрацитай) гель үүсгэсэн (Зураг 1б).Энэ нь NT ба CT нь дангаар нь хослуулан эсвэл давталттай холбоотой 37 ° C-т гель үүсэх боломжтой бөгөөд His6 шошго нь энэ процесст ямар ч мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлэхгүй гэдгийг харуулж байна.NT нь өндөр уусдаг, тогтвортой уураг бөгөөд рекомбинант спидроины гидрогелийн тухай өмнөх мэдээллүүд нь давтагдах бүс ба/эсвэл CT-ийн конформацийн өөрчлөлтөөс гелацын нөлөөлөлтэй холбоотой байдаг гэсэн нийтлэг ойлголтыг харгалзан үзвэл NT өөрөө байж болно.Желжилтийн нээлт гэнэтийн байсан.Нэмэлт Хүснэгт 1) 37, 38, 39. Гайхалтай нь NT ≥ 300 мг/мл концентрацитай үед 10 минутын дотор гельжсэн байна (Зураг 1c).NT-ийн янз бүрийн концентрацитай хуруу шилэнд урвуу оруулах туршилтууд >50 мг/мл-д NT уусмал нь харгалзах концентрацид His-NT2RepCT-ээс илүү хурдан гелжсэн болохыг харуулсан (w/v, Зураг 1c).
Энэ ажилд судлагдсан янз бүрийн spidroin бүтцийн бүдүүвч дүрслэл.b Төрөл бүрийн рекомбинант спидроины уургийн (300 мг/мл) 37 ° C-ийн гель хугацаа нь шилийг эргүүлж баталгаажуулсан.Инкубацигүйгээр шууд CT гель (<300 мг/мл), 2Rep тунадас (300 мг/мл, 5 мм масштабтай).c 37°C-д заасан уургийн концентраци дахь His-NT2RepCT ба NT-ийн гель хугацаа.d His-NT2RepCT ба NT гидрогелийн аалз болон доор нь "NT" гэсэн үсэг бүхий гэрэл зургууд (хоёулаа 200 мг/мл, масштабын бар 5 мм).
Төрөл бүрийн рекомбинант спидроины уургуудаас үүссэн гидрогель нь арай өөр өнгөтэй байдаг бөгөөд нүцгэн нүдээр ажиглахад янз бүрийн тунгалаг байдлыг харуулдаг (Зураг 1b).NT гель нь тунгалаг байдаг бол бусад гель нь тунгалаг болдог.Цилиндр хоолойд цутгасан His-NT2RepCT ба NT гелийг хэвнээс бүрэн бүтэн авч болно (Зураг 1d).
Байгалийн аалзны торгон бүрээс нь рекомбинант спидроины уургийн гелацийг үүсгэж байгаа нөхцөлд гель болж байгаа эсэхийг шалгахын тулд Шведийн гүүр аалзны (Larinioides sclopetarius) том ампулын булчирхайгаас бүрээсийг цуглуулсан.Бүрхүүлийг 20 мМ Tris-HCl буферт 50 мг/мл (хэмжсэн хуурай жин дээр үндэслэн) хадгалсан боловч 37 ° C-д 21 хоногийн инкубацийн явцад гелац ажиглагдаагүй (Нэмэлт Зураг 2a).
Эдгээр гелийг хэмжихийн тулд реологийн хэмжилтийг ашиглан гель үүсэх процессыг судалж, ерөнхий механик шинж чанарыг тодорхойлж болно.Ялангуяа өндөр температурт хадгалалтын модулийг (уян хатан чанар) хянах нь гель үүсэх температур болон бүрхүүлийн наалдамхай шинж чанарын талаар мэдээлэл өгөх боломжтой.Температурын өсөлтийн туршилтууд (байгалийн торгоны уусмалыг ашигласан өмнөх судалгаан дээр үндэслэн 25-45 ° C-д 1 ° C/мин) 40,41 His-NT2RepCT ба NT уусмалын хадгалалтын модулиуд температур нэмэгдэх тусам нэмэгдэж байгааг харуулсан.нэмэгдсэн (Зураг 2 ба Нэмэлт зураг 3).NT модуль нь His-NT2RepCT-тай харьцуулахад бага температурт ургаж эхэлсэн нь NT-ийг His-NT2RepCT-тэй 37°C-т шууд өсгөвөрлөхөд ажиглагдсан гель хугацаа илүү хурдан байсантай тохирч байна (Зураг 1).Дараа нь температур буурсны дараа хадгалах модуль нь доод утга руу буцаж ирээгүй бөгөөд алдагдлын модулиас дээгүүр хэвээр үлдсэн (Нэмэлт 3-р зургийг үз) нь дулааны эргэлт буцалтгүй тогтвортой гелацийг харуулж байна.Гельжилтийн дараа эцсийн уян хатан модуль нь 100-500 мг/мл концентрацитай His-NT2RepCT гидрогелийн хувьд 15-330 кПа, NT гидрогелийн (100-500 мг/мл) эцсийн уян хатан модуль нь 2-1400 хооронд хэлбэлзэж байв. кПа (Зураг , 2 ба налуу замын бүрэн өгөгдөл) Нэмэлт зураг 3-ыг үзнэ үү).
a His-NT2RepCT (300 мг/мл) ба b NT (300 мг/мл) сэгсрэх үед хэмжилтийн үед температурын өөрчлөлт.Сумнууд нь температурын чиг хандлагыг харуулж байгаа бөгөөд хадгалах модулийн өгөгдлийн илүү хөнгөн сүүдэр нь дуу чимээ ихсэх шалтгаан болох үйлдвэрлэгчийн заасан хэмжээнээс бага эргүүлэх моментийн утгууд дээр туршилт хийхийг харуулж байна.c Өндөр температурын дараа (100, 300, 500 мг/мл) His-NT2RepCT ба NT-ийн төгсгөлийн модулийн хуримтлал.Модулийн бүх уншилтыг 0.1 Гц давтамжтайгаар авдаг.
Гельжилттэй холбоотой конформацийн өөрчлөлтийг судлах боломжит аргын хувьд бид 37°C-т гель үүсэхээс өмнө болон дараа His-NT2RepCT ба NT-ийн FTIR спектрийг бүртгэсэн (Зураг 3a,b).Хүлээгдэж буйгаар His-NT2RepCT ба NT уусмалын спектр нь α-геликс/санамсаргүй ороомгийн хоёрдогч бүтцийг харуулсан уургуудтай тохирч, 1645 см-1-ийн тод зурвастай байна.Гидрогелийн аль алиных нь хувьд гелацийн үр дүнд дунд I зурваст 1617 см-1 ба 1695 см-1 зайд хоёр гар үүссэн (Зураг 3a, b) нь параллель β хуудасны бүтэц үүссэнийг харуулж байна.Эдгээр өөрчлөлтийг мөн тус тусын хоёр дахь дериватив ба гелацын ялгаа спектрээс тодорхой харж болно (Нэмэлт зураг 4b).NT β давхаргын хоёр зурвас нь His-NT2RepCT-ээс илүү тод байсан нь NT гидрогелийн β-давхаргын зурвасын нийт агууламж NT2RepCT гидрогелийнхээс өндөр байгааг харуулж байна.
a FTIR шингээлтийн спектрүүд His-NT2RepCT ба b NT (хоёулаа 500 мг/мл) (уусмал) ба дараа (гель) 37°С-д инкубацийн өмнө.c Дахин түдгэлзүүлсэн 50 мг/мл NT2RepCT гелийн TEM зураг ба d NT.Хэмжээний бар 200 нм.e His-NT2RepCT ба NT гидрогелийн шилэн диаметр.n = 100 хэмжсэн фибрил, p <0.0001.Алдааны мөр нь стандарт хазайлтыг харуулдаг.Алдааны мөрний төв нь дундаж юм.Статистикийн шинжилгээнд хосгүй t-тест (хоёр сүүлт) ашигласан.f Төрөл бүрийн рекомбинант спидроины уургийн ThT флюресцент (100 мг/мл) 37 0С-т сэгсрэхгүйгээр.g NT (100 мг/мл) 100 мг/мл NT гелээс 0%, 5%, 10%, 20% үрээр тарих туршилт.
Дамжуулах электрон микроскоп (TEM) ашиглан гельд хийсэн шинжилгээ нь гидрогель нь амилоид хэлбэртэй фибриллүүдээс бүрддэг болохыг харуулсан (Зураг 3c, 3d).NT үүсгэсэн фибрилүүд сунасан (5-12 нм диаметртэй), салаалаагүй байсан бол His-NT2RepCT фибрилүүдийн урт нь богино, диаметр нь мэдэгдэхүйц өргөн (7-16 нм) байв (Зураг 3e).Эдгээр үр дүн нь тиофлавины T (ThT) шинжилгээг ашиглан фиброзын кинетикийг дагах боломжийг бидэнд олгосон.Бүх рекомбинант спидроины уургийн хувьд дээжийг 37 хэмд өсгөвөрлөхөд флюресцент дохио нэмэгдсэн (Зураг 3f, Нэмэлт зураг 5а).Энэхүү олдвортой нийцүүлэн NT ба His-NT2RepCT-ийн гельжилтийн нөхцөлд микроскопийн шинжилгээгээр ThT-эерэг дүүргэгчийн орон нутгийн мэдэгдэхүйц хуримтлалгүйгээр ThT флюресценц жигд нэмэгдэж байгааг илрүүлсэн (Нэмэлт зураг 5b,c).ThT-эерэг фибрил үүсэх нь NT болон His-NTCT-ийн булингаржилтын өсөлтийг дагаагүй (Нэмэлт зураг 5d), энэ нь гель дэх фибрилүүдийн сүлжээ нь гельний тунгалаг байдлыг алдагдуулахгүйгээр үүсэх боломжтой гэсэн үг юм.Урьдчилан үүссэн фибрилүүдийг бага хэмжээгээр нэмж үржүүлэх нь зарим амилоидуудын фибрил үүсэхийг ихээхэн хурдасгах боломжтой42,43,44 гэхдээ NT гидрокоагулянтуудын уусмалд 5%, 10% эсвэл 20% (w/w) NT нэмнэ.үрийн үр нөлөө (Зураг 3g).Магадгүй энэ нь гидрогелийн фибрилүүд нь харьцангуй тогтворгүй байдаг тул үр болгон ашиглах боломжгүй байдагтай холбоотой байж болох юм.
Өндөр температурт рекомбинант спидроины уургийн гэнэтийн үйлдэл нь гель үүсэхтэй холбоотой конформацийн өөрчлөлтийг тодорхойлохын тулд цөмийн соронзон резонансын (NMR) спектроскопийн цаашдын судалгааг хийхэд хүргэв.Цаг хугацааны явцад 37°С-т бүртгэгдсэн His-NT2RepCT уусмалуудын NMR спектрүүд нь CT хэсэгчлэн нугалж, харин NT ба 2Rep дохио алга болсон (Зураг 4a) нь голчлон NT ба 2Rep нь His-NT2Rep-ийн үүсэхийг хэсэгчлэн хянадаг болохыг харуулж байна. NT2RepCT гидрогель.CT дохиог мөн анхны эрчимийнхээ 20% хүртэл сулруулсан нь CT нь ихэвчлэн тогтсон бөгөөд гидрогелийн бүтцэд шингэсэн болохыг харуулж байна.Урьдчилан инкубацийн дээж шиг хөдөлгөөнтэй, улмаар NMR уусмалаар ажиглагдсан CT-ийн жижиг хэсгийн хувьд спектрүүд эхний 10 бүтэцлэгдсэн үлдэгдлийн дохио байхгүй байгаа нь His-NT2Rep-ийн хавсаргасан хэсгийг хөдөлгөөнгүй болгоход хүндрэлтэй байгаатай холбоотой байж магадгүй юм.Гидрогелийн төлөвийн -NT2RepCT-ийн NMR спектрүүд нь α-мушгиа ба β-давхарга давамгайлж байгааг илрүүлж, бага хэмжээгээр санамсаргүй ороомгийн конформацийг илрүүлсэн (Зураг 4б).Зөвхөн NT-д агуулагдах метионины үлдэгдлийн химийн шилжилтийн шинжилгээ нь энэ домайн β хуудасны бүтэц болж хувирсан болохыг харуулсан.Уусмал дахь NT-ийн цаг хугацаанаас хамаарах спектрүүд нь дохионы эрчмийг жигд бууруулж байгааг харуулсан (Зураг 4в), NT гидрогелийн хатуу төлөвт NMR нь NT үлдэгдэл ихэнх нь β хуудасны бүтэц болж хувирсан болохыг харуулсан (Зураг 4d).2Rep-ийн нийцлийг нэгтгэх хандлагатай тул тусад нь тодорхойлох боломжгүй байв.Гэсэн хэдий ч NTCT ба His-NT2RepCT гидрогелийн хатуу төлөвийн NMR спектрүүд маш төстэй харагдаж байсан (Зураг 4b; Нэмэлт зураг 6b) нь 2Rep нь His-NT2RepCT гидрогелийн бүтцийн хэсэгт бага хувь нэмэр оруулсан болохыг харуулж байна.CT гидрогелийн хувьд α-спираль, β-хуудас, санамсаргүй мушгиа хэлбэрийн хоёрдогч бүтэц байгаа нь тогтоогдсон (Нэмэлт Зураг 6d).Энэ нь CT-ийн зарим хэсэг нь α-спираль хэвээр байхад зарим нь β хуудас болж байгааг харуулж байна.Тиймээс NMR спектроскопийн үр дүнгээс үзэхэд NT нь гидрогель үүсэхэд чухал ач холбогдолтой бөгөөд 2Rep ба CT-тэй нэгдэх үед β хуудасны конформаци болж хувирдаг.Үүнтэй уялдуулан бид саяхан амилоид орон зайн цахилгаан товч нь NT домэйны бүх таван мушгиа хэлбэрээр үүсдэг болохыг олж мэдсэн бөгөөд Вальцийн алгоритм нь 1-р мушгиа дахь амилоидоген бүсийг урьдчилан таамагласан (Зураг 4e).
15N-HSQC 10 мг/мл His-NT2RepCT уусмалын 2 хэмжээст спектрүүд (цэнхэр) ба инкубацийн дараа 19 цагийн дараа (улаан) 37°C.Улаан спектрийн бие даасан хөндлөн оргилууд ба цэнхэр спектрийн F24, G136, polyA нь нэг үсэгтэй амин хүчлийн тэмдэг болон үлдэгдэл тоогоор тэмдэглэгдсэн байдаг.Дотор нь NT, 2Rep, CT домэйнуудаас сонгогдсон үлдэгдэлд цаг хугацааны дохионы эрчмээс хамааралтай болохыг харуулж байна.b His-NT2RepCT гидрогелийн хатуу төлөвт радио давтамжийн (RFDR) спектр.RFDR спектрт ажиглагдсан Ca/Cβ үлдэгдлийн хамаарлыг пептидийн химийн шилжилтийн загвар ба статистик мэдээллээс 82,83 болон тэдгээрийн хоёрдогч бүтцээс авсан утгуудтай харьцуулан тодорхойлсон.SSB - эргэдэг хажуугийн тууз.c 15N-HSQC 10 мг/мл NT уусмалын нэг хэмжээст спектрийг 37 0С-т 36 цагийн турш инкубацийн үед.Оруулга нь эзэлхүүний эрчмийг цаг хугацаатай харуулдаг.d NT гидрогелийн хатуу төлөвт RFDR спектр.RFDR спектрт ажиглагдсан Cα/Cβ үлдэгдэл болон тэдгээрийн хоёрдогч бүтцийн хамаарлыг харуулав.e Zipper мэдээллийн баазаас (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 фибрилляцийн хандлагын профайл дээр үндэслэсэн.Гексапептидийн орон зайн аянгын шилжилтийн цонхны Розеттагийн энергийг ккал/моль-д үзүүлэв.Улаан баар нь фиброзын өндөр хандлагатай гексапептидыг илэрхийлдэг (Розеттагийн энерги -23 ккал/моль; тасархай шугамын доор).Ногоон баар нь босгыг давсан Rosetta энергитэй хэсгүүдийг заадаг тул стерик цахилгаан товч үүсгэх магадлал багатай.Пролин агуулсан фрагментуудыг шинжилгээнээс хассан (баганагүй).Квадратууд нь Вальцын алгоритм81 (https://waltz.switchlab.org) урьдчилан таамагласан амилоидозын хэсгүүдийг заадаг.NT-ийн амин хүчлийн үлдэгдлүүдийн дараалал дээд талд байгаа бөгөөд β хоёрдогч бүтцээс олдсон үлдэгдлийн төрлийг (хатуу төлөвт NMR спектроскопоор тодорхойлно) улаанаар харуулав.Таван NT α-мушгиагийн байрлалыг (H1-H5)28 гэж тодорхойлсон.
РН <6.5 үед HT димержиж, дулаан эсвэл мочевинаас үүдэлтэй денатурацид тэсвэртэй байдаг18.NT димеризаци ба тогтворжилт нь гельжилтэд хэрхэн нөлөөлдөгийг тодруулахын тулд 100 мг/мл NT агуулсан уусмалыг рН 8, 7, 6-д хуруу шилний урвуу сорил ашиглан хянасан.РН 8 ба 7-д өсгөвөрлөсөн NT дээжийг 37 ° C-т 30 минутын дараа гельжүүлсэн боловч рН 8 гель нь тунгалаг хэвээр байсан бол рН 7 гель нь харагдахуйц тунадасыг харуулсан (Зураг 5a).Үүний эсрэгээр, рН 6-д HT агуулсан уусмал нь гель үүсгэдэггүй бөгөөд 37 ° C-д 20 минутын дараа их хэмжээний тунадас харагдах болно.Энэ нь димерүүд өөрсдөө ба/эсвэл мономеруудтай харьцуулахад өндөр тогтвортой байдал нь гель үүсэхээс сэргийлдэг болохыг харуулж байна.NT нь 200 мг/мл27-д уусдаг, дулааны денатурацийн дараа амархан дахин нугалж, α-геликсийг бага утгаар хадгалдаг гэж мэдээлсэн тул рН 7 ба 6-д NT-ийн тунадас үүсэхийг хүлээгээгүй. рН 18. Эдгээр зөрүүний магадлалын тайлбар нь өмнө нь мэдээлсэн туршилтуудыг тасалгааны температур эсвэл түүнээс доош буюу уургийн харьцангуй бага концентрацитай16,18,19-д хийсэнтэй холбоотой юм.
NT хуруу шилний урвуу сорил (100 мг/мл) рН 8, 7, 6 ба 154 мМ NaCl (рН 8) 37°С-д инкубацийн дараа.b NT CD спектрүүд нь 154 мМ NaF ба 154 мМ NaCl-тэй болон тус тусгүй.222 нм-ийн молийн эллипсит нь байгалийн нугалаасны хувь хэмжээнд хувирдаг.c NT урвуу сорьц (100 мг/мл) NT* (37 °C ба 60 °C), NTA72R (37 °C), His-NT-L6 (37 °C ба 60 °C).d NT мутант NT*, NTA72R ба His-NT-L6-ийн CD спектр.222 нм-ийн молийн эллипсит нь байгалийн нугалаасны хувь хэмжээнд хувирдаг.e NTFlSp, NTMiSp ба бууруулсан NTMiSp (100 мг/мл)-ийн урвуу туршилт.Хэмжээний бар 5 мм.f NT, NTFlSp, NTMiSp ба багасгасан NTMiSp-ийн CD спектрүүд.222 нм-ийн молийн эллипсит нь байгалийн нугалаасны хувь хэмжээнд хувирдаг.25 ° C ба 95 ° C-ийн бүрэн NT спектрийг нэмэлт зураг 8-д үзүүлэв.
Физиологийн давсны концентраци нь NT дэд хэсгүүдийн хоорондох электростатик харилцан үйлчлэлийг тодорхойлдог ба NT-ийн димеризаци нь доод рН18 руу шилждэг.154 мМ NaCl ба NaF байгаа нь гелацийг дарангуйлдаг болохыг олж мэдсэн (Зураг 5a, b; Нэмэлт зураг 2b) ба эдгээр давс нь NT мономеруудын дулааны тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлдэг (Зураг 5b, Нэмэлт зураг 8) .Энэ нь димержихээс илүү тогтвортой байдлыг сайжруулах нь гель үүсэхээс сэргийлдэг болохыг харуулж байна.
Уургийн димеризаци ба гелацийн тогтворжилтын үүргийг цаашид судлахын тулд бид NT* ба NTA72R гэсэн хоёр мутантыг ашигласан бөгөөд тэдгээр нь мөн бага рН28.30-д мономер хэвээр байна.NT* нь давхар цэнэгийн урвуу мутант бөгөөд мономерын илэрхий диполяр цэнэгийн тархалт хавтгайрсан бөгөөд энэ нь димержихээс сэргийлж, мономерын тогтвортой байдлыг эрс нэмэгдүүлдэг.NTA72R нь цэнэгтэй диполь боловч Арг орлуулсан Ала нь димерийн хил дээр байрладаг тул мутаци нь димержихэд шаардлагатай дэд нэгжийн харилцан үйлчлэлд саад учруулдаг.37°С-т өсгөвөрлөхөд NT* нь гидрогель үүсгээгүй бол NTA72R 15 минутын турш тунгалаг гель үүсгэсэн (Зураг 5c).NT* болон NTA72R хоёулаа димержих боломжгүй боловч мономерын тогтвортой байдлын хувьд ялгаатай байдаг (Зураг 5d) эдгээр үр дүн нь термодинамикийн өндөр тогтвортой байдал нь NT-ийг гель үүсэхээс сэргийлдэг болохыг баттай харуулж байна.HT* нь өндөр температурт тогтворгүй байх үед (60°С-т 8 минутын дараа; Зураг 5в) гель үүсгэдэг нь үүнийг баталж байна.NT-д агуулагдах метионины өндөр агууламж нь байгалийн нугалаа шингэрүүлж, зургаан Met to Leu орлуулагч (энд His-NT-L6 гэж нэрлэдэг) нь NT46 мономерыг хүчтэй тогтворжуулдаг болохыг өмнө нь харуулсан.NT гель үүсэхэд бүтцийн уян хатан байдал шаардлагатай гэсэн таамаглал дээр үндэслэн His-NT-L6 тогтвортой мутант 37 ° C-т гель үүсээгүй болохыг олж мэдсэн (Зураг 5c, d).Гэсэн хэдий ч His-NT-L6 нь мөн 60°С-т 60 минутын турш өсгөвөрлөхөд гель үүсгэсэн (Зураг 5c).
NT-ийн β хуудасны бүтэц болж хувирах, гидрогель үүсгэх чадвар нь спидроины бүх NT домэйнд хамаарахгүй ч зарим хэсэгт хамааралтай юм шиг санагддаг.Төрөл бүрийн торгоны төрөл, аалзны төрөл зүйл болох Trichonephila clavipes (NTFlSp) нь метионины агууламж харьцангуй бага, дулааны тогтвортой байдал нь өндөр байсан ч гель үүсгэдэг (Зураг 5e, f ба Нэмэлт Хүснэгт 2).Үүний эсрэгээр, бага дулаан тогтворжилттой, метионины агууламж өндөртэй Araneus ventricosus (NTMiSp)-ийн жижиг ампуляр уургийн спидроины NT нь гидрогель үүсгэдэггүй (Нэмэлт Хүснэгт 2 ба Зураг 5e, f).Сүүлийнх нь молекул доторх дисульфидын холбоо байгаатай холбоотой байж болно29,47.NTMiSp-ийн дисульфидын холбоо буурахад 37°С-т 10 минутын турш инкубацийн дараа гидрогель үүсгэсэн (Зураг 5e).Эцэст нь хэлэхэд бүтцийн уян хатан чанар нь NT-ээс гель үүсэх цорын ганц шалгуур биш боловч чухал гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.Хамаарах өөр нэг хүчин зүйл бол амилоид фибрил үүсэх хандлага бөгөөд цахилгаан товч мэдээллийн сан болон Вальц алгоритмын тусламжтайгаар хийсэн дүн шинжилгээ нь гель үүсгэх чадвар, амилоидогенийн бүс нутаг, түүнчлэн урьдчилан таамаглаж буй бүс нутгийн хэмжээ хоорондын хамаарлыг харуулсан. стерик цахилгаан товч үүсгэх.Корреляци байсан (Нэмэлт Хүснэгт 2 ба Нэмэлт Зураг 9).
Тохиромжтой нөхцөлд фибрил үүсгэж, гель үүсгэх NT-ийн чадвар нь бусад уургийн хэсгүүдтэй NT хайлуулж, нэгтгэх түншүүдийн бүрэн ажиллагаатай гель үүсгэж болно гэсэн таамаглалыг бидэнд хүргэсэн.Үүнийг шалгахын тулд бид ногоон флюресцент уураг (GFP) ба пурин нуклеозид фосфорилаза (PNP) -ийг NT-ийн С төгсгөлд тус тус нэвтрүүлсэн.Үүссэн хайлуулах уургууд нь маш өндөр эцсийн гарцтай (His-NT-GFP болон His-NT-PNP-ийн 150 мг/л ба 256 мг/л колбоны өсгөвөр) E. coli-д илэрхийлэгдэж, харуулсантай нийцэж байна. NT-д ууссан бусад уургийн хувьд Ref.30. His-NT-GFP (300мг/мл) ба His-NT-PNP (100мг/мл) хайлуулах уургууд нь 37°С-т 2 цаг 6.5 цагийн дараа гель үүсгэсэн бөгөөд хамгийн чухал нь GFP фракц өөрчлөгдөөгүй хэвээр байна.гельжүүлсний дараа ажиглагдсан ба гелацийн дараа анхны флюресценцийн эрчмийн >70% үлддэг (Зураг 6a).Түүний-NT-PNP уусмал болон гель дэх PNP-ийн идэвхийг хэмжихийн тулд бид хайлуулах уургийг NT-тэй шингэлэх шаардлагатай болсон, учир нь цэвэр бэлдмэлийн ферментийн идэвхжил нь гель үүсэх концентраци дахь шинжилгээний илрүүлэх хязгаараас гадуур байсан.0.01 мг/мл His-NT-PNP ба 100 мг/мл NT агуулсан хольцоор үүсгэсэн гель нь урьдчилан өсгөвөрлөсөн дээжийн анхны ферментийн идэвхийн 65%-ийг хадгалсан (Зураг 6б).Хэмжилтийн явцад гель хэвээр үлдсэн (Нэмэлт зураг 10).
a His-NT-GFP (300 мг/мл) болон His-NT-GFP гидрогель (300 мг/мл) агуулсан урвуу хэлбэртэй хуруу шилэнд харагдах ба хэт ягаан туяаны гэрэлд гель үүсэхээс өмнөх ба дараа флюресценцийн харьцангуй эрчим.Оноо нь бие даасан хэмжилтийг (n = 3), алдааны мөр нь стандарт хазайлтыг харуулдаг.Дундаж утгыг алдааны мөрний төвд харуулав.b PNP-ийн идэвхийг NT (100 мг/мл) ба 0.01 мг/мл his-NT-PNP, 100 мг/мл Шинэ Тайван доллар агуулсан хольцоос бүрдсэн уусмал, гель ашиглан флюрометрийн шинжилгээгээр олж авсан.Дотор нь His-NT-PNP (5 мм масштабтай баар) агуулсан гидрогель агуулсан урвуу хэлбэртэй шилийг харуулж байна.
Энд бид уургийн уусмалыг 37°С-т өсгөвөрлөх замаар NT болон бусад рекомбинант спидроины уургуудаас гидрогель үүссэнийг мэдээлэв (Зураг 1).Желжилт нь α-спираль β-давхарга болж хувирах, амилоид шиг фибрил үүсэхтэй холбоотой болохыг бид харуулж байна (Зураг 3, 4).NT нь маш өндөр уусах чадвартай, 4°С-т хэдэн өдрийн турш >200 мг/мл концентрацид өндөр тогтвортой байдгаараа алдартай ороомог хэлбэртэй бөмбөрцөг хэлбэртэй таван спираль багцууд тул энэ олдвор нь гайхалтай юм27.Нэмж дурдахад, NT-ууд нь μM дахь уургийн бага концентрацид дулааны денатурацийн дараа амархан дахин сэргэдэг.Бидний үр дүнгээс үзэхэд фибрил үүсэхэд >10 мг/мл уургийн концентраци болон бага зэрэг өндөр температурын хослол шаардлагатай (Зураг 1).Энэ нь физиологийн нөхцөлд дулааны хэлбэлзлийн улмаас хэсэгчлэн задарсан төлөвт байгаа бөмбөрцөг хэлбэртэй атираат уургуудаас амилоид фибрил үүсч болно гэсэн санаатай нийцэж байна 48 .Инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин, лизоцим51,52,53 зэрэг ийм хувиралд ордог уургийн жишээнүүд орно.Хэдийгээр NT нь төрөлх төлөвдөө α-геликс боловч полипептидийн гинжин хэлхээний ойролцоогоор 65% нь стерик цахилгаан товч үүсэхтэй нийцдэг (Зураг 4e) 45 .Мономер нь динамик хөдөлгөөнтэй46 тул дунд зэргийн өндөр температурт эдгээр боломжит амилоидоген бүсүүдийг ил гаргаж, нийт уургийн өндөр концентрацид амилоид фибрил үүсэх чухал концентрацид хүрч чаддаг54.Энэ үндэслэлийн дагуу бид спидроины концентраци ба гелацийн хугацаа хоёрын хооронд сөрөг хамаарал байгааг олж мэдсэн (Зураг 1c) ба хэрэв мономер NT конформац нь мутаци (NT*, His-NT-L6) эсвэл давс нэмсэнээр тогтворжсон бол энэ өвчнөөс урьдчилан сэргийлэх боломжтой. үүсэх гидрогель (Зураг 5).
Ихэнх тохиолдолд амилоид фибрил нь уусмалаас тунадас хэлбэрээр алга болдог боловч тодорхой нөхцөлд гидрогель үүсгэдэг55,56,57.Гидрогель үүсгэгч фибрил нь ихэвчлэн өндөр харьцаатай байдаг ба молекулын орооцолдолоор тогтвортой гурван хэмжээст сүлжээ үүсгэдэг нь бидний үр дүнтэй нийцэж байгаа55,58.In vitro гидрогель үүсэхийн тулд уураг нь ихэвчлэн органик уусгагч, өндөр температур (70-90 ° C) ба/эсвэл бага рН (1.5-3.0) 59,60,61,62 зэрэгт бүрэн эсвэл хэсэгчлэн задалдаг.Энд тайлбарласан спидроины гидрогель нь хатуу боловсруулалт шаарддаггүй, мөн гидрогелийг тогтворжуулахын тулд хөндлөн холбох бодис шаарддаггүй.
Торгоны ээрэх явцад β-хуудас солигдох мэт харагддаг спидроины давталт ба QD нь гидрогель үүсгэдэг гэж өмнө нь мэдээлж байсан.Бидний олдвортой харьцуулахад инкубацийн хугацаа ба/эсвэл инкубацийн температур нь тус тусад нь мэдэгдэхүйц урт буюу өндөр байсан бөгөөд үүссэн гидрогель нь ихэвчлэн тунгалаг байдаг (Зураг 7 ба Нэмэлт Хүснэгт 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Хурдан гель хэрэглэх хугацаанаас гадна NT гидрогель >300 мг/мл (30%) нь бусад тайлбарласан рекомбинант аалзны торгоны уургийн гидрогель, мөн желатин, алгинат (2%), агар (0.5%) зэрэг байгалийн гидрогелүүдээс илүү сайн ажилласан. ) ба коллаген.(0.6%) (Зураг 7 ба нэмэлт 1 ба 3-р хүснэгт)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Энэхүү судалгаанд хамрагдсан гидрогелийн гельний хугацаа, уян хатан модулийг бусад спидроин дээр суурилсан гидрогель болон сонгосон байгалийн гидрогельтэй харьцуулсан.Ишлэлийг гельжилтийн нөхцлийн тайлбарын хамт өгсөн болно.APS Аммонийн персульфат, өрөөний температур.Өгөгдөл 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Аалзнууд нь спидроиныг хадгалах явцад гель үүсэхээс сэргийлэх аргыг боловсруулсан бололтой.Торгоны булчирхай дахь уургийн өндөр концентрацитай хэдий ч төгсгөлийн бүстэй холбоотой том давталтын бүс нь энэ судалгааны хил дээр булчирхай дахь NT ба CT-ийн илэрхий концентраци ойролцоогоор 10-20 мг / мл-тэй тохирч байна гэсэн үг юм.in vitro ажиглагдсан гидрогель үүсэхэд шаардлагатай.Үүнээс гадна, торго булчирхай (Зураг. 5b) адил давс 16 ижил төстэй концентраци, тогтворжуулсан NT.NT-ийн конформацийг E. coli цитозолд судалсан бөгөөд in vitro шинжилгээнээс илүү нягт нугалж байгаа нь давс эсвэл бусад хүчин зүйл нь in vivo агрегацияд саад болж байгааг харуулж байна.Гэсэн хэдий ч NT-ийн β хуудасны фибрил болгон хувиргах чадвар нь утас үүсэхэд чухал ач холбогдолтой байж болох тул цаашдын судалгаанд судлах шаардлагатай.
Энэхүү судалгаанд ажиглагдсан NT-амилоид шиг фибрил ба гидрогелийн формацийн шинэлэг талуудаас гадна бид энэ үзэгдэл биотехнологи болон биоанагаахын хэрэглээтэй байж болохыг харуулж байна (Зураг 8).Үзэл баримтлалын нотолгоо болгон бид NT-ийг GFP эсвэл PNP-тэй хослуулсан ба хайлуулах уураг нь 37 ° C-д өсгөвөрлөхөд гидрогель үүсгэдэг болохыг харуулсан бөгөөд GFP болон PNP фракцууд нь гелацийн дараа үйл ажиллагаагаа ихээхэн хэмжээгээр хадгалж байдаг (Зураг 6).Нуклеозид фосфорилаза нь нуклеозидын аналогийн нийлэгжилтийн чухал катализаторууд юм75, энэ нь бидний нээлтийг биофармацевтикийн салбарт хамааралтай болгож байна.Тохиромжтой нөхцөлд тунгалаг гидрогель үүсгэдэг хайлуулах уургийг илэрхийлэх үзэл баримтлал нь ферментийг хөдөлгөөнгүй болгох, эмийн хяналттай ялгаралт, эд эсийн инженерчлэл зэрэг өргөн хүрээний хэрэглээнд таатай шинж чанартай функциональ гидрогелийг бий болгох боломжийг олгодог.Нэмж дурдахад NT ба NT* нь илэрхийллийн үр дүнтэй маркер30 бөгөөд энэ нь NT болон түүний хувилбаруудыг уусдаг уусдаг уураг үйлдвэрлэх, улмаар 3D гидрогель дотор хөдөлгөөнгүй зорилтот уураг үүсгэхэд ашиглаж болно гэсэн үг юм.
NT нь уусдаг, α-спираль хэлбэртэй бөгөөд бага концентраци (μM) болон 37°C-т тогтвортой байдаг.Ижил температурт, гэхдээ концентраци ихсэх үед (>10 мг / мл) NT нь амилоид шиг фибриллээс бүрдсэн гель үүсгэдэг.NT хайлуулах уургууд нь бүрэн ажиллагаатай хайлуулах хэсгүүд бүхий фибрилляр гель үүсгэдэг бөгөөд NT ашиглан янз бүрийн уургийг 3D гидрогелд хөдөлгөөнгүй болгох боломжийг олгодог.Доод талд: NT (PDB: 4FBS) ба шилэн сүлжээ болон холбогдох уургийн бүтцийн зураг (хүссэн ба масштабаар зураагүй, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4Rd).
Бүтэцүүдийг (амин хүчлийн дарааллыг агуулсан бүрэн жагсаалтыг Нэмэлт Хүснэгт 4-ээс үзнэ үү) pT7 плазмид болж, E. coli BL21 (DE3) болгон хувиргасан.Инженерийн боловсруулсан плазмид агуулсан E. coli-г канамицин (70 мг/л) агуулсан Луриа шөлөнд тарьж, 30°С, 250 эрг/мин температурт шөнийн турш ургуулсан.Дараа нь өсгөвөрийг канамицин агуулсан LB орчинд 1/100-ээр тарьж, OD600 0.8 хүрэх хүртэл 30°C, 110 rpm-д өсгөвөрлөв.NMR судалгаанд 2 г D-глюкоз 13С (Алдрих) болон 1 г аммонийн хлорид 15N (Кэмбриж изотопын лаборатори, Inc.) агуулсан M9 хамгийн бага орчинд бактерийг изотопоор уураг шошголох зорилгоор ургуулсан.Температурыг 20 хэм хүртэл бууруулж, 0.15 мм изопропилтиогалактопиранозид (эцсийн концентраци) -аар уургийн илэрхийлэлийг өдөө.Шөнийн уураг илэрхийлсний дараа эсийг 7278 × г, 4 ° C температурт 20 минутын турш цуглуулсан.Эсийн үрэлийг 20 мМ Tris-HCl, рН 8-д дахин түдгэлзүүлж, цаашид хэрэглэх хүртэл хөлдөөсөн.Гэсгээсэн эсүүдийг 30 кПа температурт эсийн задлагч (TS цувралын машин, Constant Systems Limited, Англи) ашиглан задалсан.Дараа нь лизатуудыг 40С-т 30 минутын турш 25,000 г-т центрифуг хийсэн.NTMiSp-ийн хувьд үрэлийг дараа нь 2 М мочевин, 20 мм Tris-HCl, рН 8-д дахин түдгэлзүүлж, 2 минутын турш (2 секундын асаалттай/унтраалттай, 65%) дууны туяанд хийн, дараа нь 25,000 xg, 4°С-т дахин центрифуг хийсэн. 30 мин.Супернатантыг Ni-NTA баганад ачиж, 20 мМ Tris-HCl, 2 мМ имидазол, рН 8-аар угааж, эцэст нь уургийг 20 мМ Tris-HCl, 200 мм имидазол, рН 8-аар цэвэрлэв. NT2Rep үүсгэх ба NT2Rep үүсгэхийн тулд NTCT, тромбины задаргаа нь түүний болон NT-ийн хоорондох газрыг (ThrCleav) танилцуулдаг.Тромбины задралын хэсгүүд нь His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep үүсгэдэг), His-thoredoxin-ThrCleav-NT (NT үүсгэдэг), His-thoredoxin-ThrCleav-CT (CT үүсгэдэг), His-thioredoxin-ThrCleav-NT зэрэгт байдаг. .* (NT* үүсгэдэг), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R үүсгэдэг), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp үүсгэдэг) болон His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp үйлдвэрлэдэг).Бүтэцүүдийг тромбиноор (1:1000) шингээж, 6-8 кДа молекулын жингийн босго бүхий Spectra/Por диализийн мембраныг ашиглан 20 мМ Tris-HCl, рН 8-тай 4°С-т шөнийн турш диализ хийсэн.Диализ хийсний дараа уусмалыг Ni-NTA баганад ачиж, сонирхож буй уураг агуулсан бохир усыг цуглуулдаг.Уургийн концентрацийг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу Брэдфордын шинжилгээг ашигласан NTF1Sp-ээс бусад уураг тус бүрийн устах коэффициентийг ашиглан 280 нм-ийн хэт ягаан туяаны шингээлтийг хэмжих замаар тодорхойлсон.Цэвэршилтийг SDS полиакриламид (4-20%) гель электрофорез болон Coomassie гялалзсан хөх будгаар тодорхойлно.Уургийг центрифугийн шүүлтүүр (VivaSpin 20, GE Healthcare) ашиглан 4000 хг-д 10 кДа молекулын жинг хязгаарлаж, 20 минутын циклээр баяжуулсан.
Уургийн уусмалыг гэсгээж, 150 мкл-ийг 1 мл тунгалаг таславчтай хуруу шилэнд (8 х 40 мм Thermo Scientific) болгоомжтой хийнэ.Ууршилтаас сэргийлэхийн тулд хоолойнуудыг таглаж, парафильмээр битүүмжилсэн.Дээжийг (n = 3) 37 ° C эсвэл 60 ° C-д өсгөвөрлөж, гелацийг ажиглахын тулд үе үе эргүүлэв.Гельгүй дээжийг дор хаяж нэг долоо хоног өсгөвөрлөсөн.NTMiSp дисульфидын холбоог 10 μM уураг тутамд 10 мм DTT-ээр багасгана.Байгалийн аалзны торгон бүрхүүлийн гелацийг шинжлэхийн тулд Шведийн гүүрний аалзыг зүсэж, хоёр үндсэн ампуляцитай булчирхайг 200 мкл 20 мМ Tris-HCl буферийн рН 8-д хийж, бүрээсийг булчирхайгаас салгахын тулд зүссэн..Булчирхайн агуулгыг буферт уусгаж, хуурай жинг тодорхойлоход 50 мкл (онгорхой шилийг 60 ° C температурт тогтмол жинд өсгөвөрлөх замаар), 37 ° C-т гельжүүлэхэд 150 мкл.
Хэмжих геометр / багаж нь 20 мм-ийн диаметртэй, 0.5 мм-ийн зайтай зэрэгцээ хавтанг ашиглан зэвэрдэггүй гангаар хийгдсэн.Дээжийг 25 ° C-аас 45 ° C хүртэл халааж, 25 ° C хүртэл минутанд 1 ° C-ийн хурдтайгаар зэвэрдэггүй ган ёроолтой Пелтиер хавтанг ашиглан халаана.Чичиргээний хэмжилтийг 0.1 Гц давтамжтайгаар, материалын шугаман наалдамхай бүсэд 100 мг/мл ба 300-500 мг/мл дээжийн хувьд 5% ба 0.5%-ийн омог дээр тус тус хийсэн.Ууршилтаас сэргийлэхийн тулд тусгай чийгшлийн камер ашиглана.Prism 9 ашиглан өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийсэн.
Өрөөний температурт 800-аас 3900 см-1 хүртэлх хэт улаан туяаны (IR) спектрийг цуглуулахад зориулагдсан.ATR төхөөрөмж, түүнчлэн спектрометрээр дамжин өнгөрөх гэрлийн замыг туршилтын өмнө болон туршилтын явцад хуурай шүүсэн агаараар цэвэрлэнэ.Уусмалыг (спектр дэх ус шингээлтийн оргилыг багасгахын тулд 500 мг/мл) талстууд дээр соруулж, хэмжилт хийхээс өмнө гель (500 мг/мл) үүсгэж, дараа нь талстууд руу шилжүүлсэн (n = 3).2 см-1 нарийвчлалтайгаар 1000 сканнердсан ба 2-ын тэг ажлын мөчлөг. Хоёр дахь деривативыг есөн цэгийн тэгшитгэх хүрээ ашиглан OPUS (Bruker) ашиглан тооцоолсон.Ф.Менгесийн “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” ашиглан 1720-1580 см-1-ийн хоорондох ижил интеграцийн мужид спектрүүдийг хэвийн болгосон.ATR-IR спектроскопийн хувьд хэт улаан туяаны туяаг дээжинд нэвтрүүлэх гүн нь долгионы тооноос хамаардаг тул өндөр долгионы тооноос бага долгионы тоонд илүү хүчтэй шингээлтийг бий болгодог.Зурагт үзүүлсэн спектрийн хувьд эдгээр нөлөөг засаагүй болно.3 учир нь тэдгээр нь маш жижиг (Нэмэлт зураг 4).Энэ зургийн залруулсан спектрийг Bruker OPUS программ хангамжийг ашиглан тооцоолсон.
Зарчмын хувьд амидын I оргилд багтах бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн найдвартай задралын дараа уургийн бүтцийн иж бүрэн хэмжээг тодорхойлох боломжтой.Гэсэн хэдий ч практик дээр зарим саад бэрхшээлүүд гарч ирдэг.Спектр дэх чимээ шуугиан нь задралын үед (хуурамч) оргилууд шиг харагдаж болно.Үүнээс гадна усны гулзайлтын улмаас үүссэн оргил нь амидын I оргилын байрлалтай давхцаж байгаа бөгөөд энд судлагдсан усан гель гэх мэт их хэмжээний ус агуулсан дээжийн хувьд ижил хэмжээтэй байж болно.Тиймээс бид амид I оргилыг бүрэн задлахыг оролдоогүй бөгөөд бидний ажиглалтыг зөвхөн NMR спектроскопи гэх мэт бусад аргуудыг дэмжих үүднээс авч үзэх хэрэгтэй.
50 мг/мл NT ба His-NT2RepCT-ийн уусмалыг 37°С-т шөнийн турш гель болгосон.Дараа нь гидрогелийг 20 мМ Tris-HCl (рН 8) -аар 12.5 мг/мл концентрацитай болтол шингэлж, сайтар сэгсэрч, соруулж хэрэглэж гелийг хугалав.Дараа нь гидрогелийг 20 мм Tris-HCl (рН 8) -аар 10 удаа шингэлж, 5 мкл дээжийг формвараар бүрсэн зэс торонд түрхэж, илүүдэл дээжийг арилгах цаасаар арилгасан.Дээжийг 5 мкл MilliQ усаар хоёр удаа угааж, 1% уранил форматаар 5 минутын турш будсан.Илүүдэл толбыг шингээгч цаасаар арилгаж, дараа нь торыг агаарт хатаана.Эдгээр сүлжээнд 100 кВ-т ажилладаг FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ашиглан дүрслэл хийсэн.Зургийг Veleta 2k × 2k CCD камер (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Мюнстер, Герман) ашиглан x 26,500 ба x 43,000 томруулж авсан.Дээж бүрийн хувьд (n = 1) 10-15 зураг бүртгэгдсэн.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) нь зургийн шинжилгээ, шилэн диаметрийг хэмжихэд ашигласан (n = 100, өөр өөр утас).Призм 9-ийг хосгүй t-тест (хоёр сүүлт) хийхэд ашигласан.His-NT2RepCT ба NT фибрилүүдийн дундаж нь 11.43 (SD 2.035) ба 7.67 (SD 1.389) нм байв.Итгэлийн интервал (95%) -4.246-аас -3.275 байна.эрх чөлөөний зэрэг = 198, p <0.0001.
10 мкМ тиофлавин T (ThT) агуулсан 80 мкл шингэний дээжийг Corning 96 цооногтой хар ёроолын тунгалаг ёроолын ялтсуудыг (Corning Glass 3881, АНУ) ашиглан статик нөхцөлд гурав дахин (n = 3) хэмжсэн.Флюресценцийн ялгааг 440 нм өдөөх шүүлтүүр ба 480 нм ялгаруулалтын шүүлтүүр (Герман, Оффенбург, BMG Labtech-ийн FLUOStar Galaxy) ашиглан бүртгэсэн.ThT-ийн янз бүрийн концентрацитай туршилтыг дохионы эрчмийг өөрчлөхгүйгээр хийсэн тул ThT дохио нь ханасан эсвэл унтарсангүй.Манангийн хэмжилтийн хувьд 360 нм долгионы долгионы шингээлтийг тэмдэглэнэ.Үр тарих туршилтын хувьд 100 мг/мл гелийг 37°С-т үүсгэж, дахин түдгэлзүүлж, 5%, 10%, 20% молийн харьцаагаар үржүүлэхэд ашигласан.Prism 9 ашиглан өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийсэн.
His-NT2RepCT ба NT >100 мг/мл-ийн нөөцийг мөсөн дээр гэсгээж, 0.22 мкм шүүлтүүрээр шүүнэ.Нанодроп ашиглан 280 нм-ийн гэрэл шингээх чадварыг хэмжих замаар концентрацийг тооцоолсон.Тунгалаг ёроолтой 96 цооногтой хар өнгийн холбогч хавтангийн (Корнинг) худагт дээжийг 20 мг/мл хүртэл 20 мМ Tris-HCl рН 8-д шингэлж, 5 мкМ ThT (эцсийн концентраци), дээжийн нийт концентрацитай хольсон. 50 мкл эзэлхүүн.Дээжийг 10 минут тутамд 37 °C температурт CellObserver (Zeiss) микроскопоор дамжуулсан гэрлийн суваг болон ThT дүрслэлд зориулсан FITC өдөөлт, ялгаруулалтын шүүлтүүрээр дүрсэлсэн.Зураг авахад 20x/0.4 линз ашигладаг.Зургийн шинжилгээнд Zen Blue (Zeiss) болон ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ашигласан.Мөн NT ба His-NT2RepCT уусмалаас 20 мМ Tris рН 8 ба 5 мкМ ThT агуулсан 50 мг/мл концентрацид гель бэлтгэж, 37°С-т 90 минутын турш өсгөвөрлөсөн.Гель хэсгүүдийг 20 мМ Tris, рН 8, 5 мкМ ThT агуулсан шинэ цооногоор холбодоггүй хар 96 худгийн тунгалаг ёроолын хавтан руу шилжүүлэв.Ногоон флюресцент болон тод талбайн зургийг 20x/0.4 өсгөлтөөр авах.ImageJ-г зургийн шинжилгээнд ашигласан.
Уусмалын NMR спектрийг QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) -ээр тоноглогдсон 600 МГц Bruker Avance Neo спектрометр дээр 310 К-т авсан.20 мМ Tris-HCl (рН 8), 0.02% (х/х) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) -д ууссан, 13C, 15N гэсэн шошготой 10 мг/мл нэгэн төрлийн уураг агуулсан NMR дээж. .15N-HSQC-ийн 2D спектрийн оргил 23-ыг тогтоохын тулд NT2RepCT-ийн рН 6.7-ийн химийн шилжилтийг ашигласан.
13C, 15N шошготой гидрогелийн шидэт өнцгийн ээрэх хатуу NMR (MAS) спектрийг 3.2 мм 13C/15N{1H} электронгүй датчикаар тоноглогдсон 800 МГц давтамжтай Bruker Avance III HD спектрометр дээр тэмдэглэв.Дээжийн температурыг 277 К-ийн хувьсах температурт хийн урсгалыг ашиглан удирдсан. Хоёр хэмжээст диполь эргэлтийн резонансын (DARR)76 ба радио давтамжийн дахин холболтын (RFDR)77 спектрийг ШУА-ийн 12.5 кГц ба 20 кГц давтамжтайгаар тус тус авсан.1H-ээс 13С хүртэлх хөндлөн туйлшралыг (CP) 1H-д 60.0-аас 48.0 кГц, 13С-т 61.3/71.6 кГц (ШУА-ийн 12.5/20 кГц) ба холбоо барих хугацаа 0.5-1 мс-ийг ашиглан гүйцэтгэсэн.Мэдээлэл цуглуулахдаа 73.5 кГц давтамжтайгаар Spinal6478 салгах аргыг ашигласан.Авах хугацаа 10 миллисекунд, мөчлөгийн саатал 2.5 секунд байв.RFDR спектрт ажиглагдсан дан холбоост Cα/Cβ хамаарлыг DARR спектр дэх үлдэгдэл төрлийн химийн шилжилт ба үржүүлэлтийн хамаарал дээр үндэслэн тогтоосон.
Zipper79 мэдээллийн баазыг (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp, NTMiSp-ийн хэлбэлзлийн хандлага болон Rosetta энергийг үнэлэхэд ашигласан.Zipper мэдээллийн сан нь уургийн бүтцийг загварчлах, шинжлэхэд хэд хэдэн чөлөөт энергийн функцуудыг нэгтгэсэн Rosetta Energy80-ийг тооцоолдог.Эрчим хүчний түвшин -23 ккал/моль ба түүнээс доош байвал фибрилляци үүсэх хандлага их байгааг илтгэнэ.Эрчим хүч бага байна гэдэг нь цахилгаан товч хэлбэрийн хоёр β утас илүү тогтвортой байна гэсэн үг.Нэмж дурдахад NT, NTFlSp, NTMiSp Ref-ийн амилоидогенийн бүс нутгийг урьдчилан таамаглахад Waltz алгоритмыг ашигласан.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT уургийн уусмалыг рН 5.5 ба 6.0-д 2-(N-морфолино)этансульфоны хүчил (MES) буфертэй хольж, рН-ийг рН 6 ба 7 болгон бууруулсан.Эцсийн уургийн концентраци 100 мг / мл байна.
Хэмжилтийг J-1500 CD спектрометр (JASCO, АНУ) дээр 0.1 см-ийн оптик замтай 300 мкл кювет ашиглан хийсэн.Уургийг 20 мМ фосфатын буферт (рН 8) 10 μM (n = 1) хүртэл шингэлсэн.Давс байгаа нөхцөлд уургийн тогтвортой байдалд дүн шинжилгээ хийхийн тулд уурагуудыг 154 мМ NaF эсвэл NaCl агуулсан 20 мМ фосфатын буфер (рН 8) дахь ижил концентрацид (n = 1) шинжилсэн.Температурын сканнерыг 222 нм-ийн 25 ° С-аас 95 ° С-ийн температурт 1 ° С/мин халаах хурдтайгаар бүртгэсэн.Төрөлхийн атираат уургийн эзлэх хувийг (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) томъёог ашиглан тооцоолсон.Түүнчлэн дээж тус бүрт 25°С-т 260 нм-ээс 190 нм хүртэл, 95°С хүртэл халаасны дараа таван спектрийг бүртгэсэн.Таван спектрийг дундажлаж, жигдрүүлж, молийн эллипс болгон хувиргасан.Prism 9 ашиглан өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийсэн.
His-NT-GFP (300 мг/мл, 80 мкл) флюресценцийн эрчмийг статик нөхцөлд хар тунгалаг ёроолтой 96 цооногтой (Corning Glass 3881, АНУ) Corning хавтангуудад гурав дахин (n = 3) хэмжсэн.Дээжийг 395 нм-ийн өдөөх долгионы урттай флюресценцэд суурилсан хавтан уншигчаар хэмжиж, гель үүсэхээс өмнө 509 нм, 2 цагийн дараа 37°С-т ялгаралтыг тэмдэглэнэ.Өгөгдлийг Prism 9 ашиглан шинжилсэн.
Пурины нуклеозид фосфорилазын үйл ажиллагааны шинжилгээний иж бүрдэл (флюрометрийн арга, Сигма Олдрих) үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу ашигласан.His-NT-PNP агуулсан гель болон уусмал дахь идэвхийг хэмжихийн тулд гель нь багцын илрүүлэх интервалаас дээш дохио өгсөн тул 10 нг His-NT-PNP-ийг 100 мг/мл NT-тай нийт 2 мкл эзэлхүүнтэй холино.His-NT-PNP-гүй гель болон уусмалын хяналтыг оруулсан болно.Хэмжилтийг хоёр удаа хийсэн (n = 2).Үйл ажиллагааг хэмжсэний дараа урвалын хольцыг зайлуулж, хэмжилтийн явцад гель бүрэн бүтэн хэвээр байгаа эсэхийг баталгаажуулахын тулд гелийн зургийг авсан.Prism 9 ашиглан өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийсэн.
Судалгааны дизайны талаар нэмэлт мэдээлэл авахыг хүсвэл энэ нийтлэлтэй холбоотой Байгаль судлалын хураангуйг үзнэ үү.
1 ба 2-р зурагт анхны өгөгдлийг харуулав.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, and 6, Нэмэлт зураг.3, нэмэлт зураг.5a, d, нэмэлт зураг.6 ба нэмэлт зураг.8. Энэхүү судалгааны өгөгдлийн өгөгдлийг Zenodo мэдээллийн санд байршуулсан болно https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Энэхүү судалгаагаар олж авсан NMR өгөгдлийг bmrbig36 бүртгэлийн ID дор BMRBig репозиторт байршуулсан.GFP болон PNP-ийн бүтцийг PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2)-аас авсан.
Rising, A. and Johansson, J. Spinning хиймэл аалзны торго.Үндэсний химийн .биологи.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Нефила клавипес геном нь аалзны торгон генийн олон янз байдал, тэдгээрийн цогц илэрхийлэлийг онцлон харуулдаг.Үндэсний Женет.49, 895–903 (2017).